冯晓娟，郑倩，冯亚岚，黄荣，杨健，袁磊

(川北医学院基础医学与法医学院，1.机能学实验教学中心，2.病原生物学教研室，四川 南充 637000)

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种经蚊虫叮咬传播的人兽共患病，可导致人中枢神经系统严重损伤[1]。JEV主要流行于亚洲地区，全球每年报告67 900例临床病例，其中约75%发生于0～14岁的儿童，病死亡率20%～30%，约有50%的治愈者会留下持续性后遗症[2]。目前尚无特异性疗法，只能对症治疗。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA分子介导的使靶mRNA发生特异性降解，以阻断翻译，即转录后的基因沉默，在高等生物基因表达调控和抵御病原体过程中发挥重要作用[3]。目前人工合成的siRNA可以直接转染到细胞中介导RNAi，但时效较短。使用含有短发夹RNA (shRNA)表达盒的质粒或病毒载体在细胞中生成siRNA，可以显著提高RNAi的效率和持续性。慢病毒对多种细胞有较强亲和力与低毒性，是目前较为理想的RNAi传导工具[4]。RNAi分子治疗有可能成为一种新的抗病毒策略。多项研究[5-7]表明，运用RNAi可以有效抑制蜱传脑炎病毒、登革热病毒和丙型肝炎病毒等黄病毒在细胞和小鼠体内的增殖。本研究以同为黄病毒属的JEV为对象，选取4个病毒基因作为靶点，使用慢病毒载体分别在BHK21细胞和小鼠体内介导RNAi，研究其抗病毒效果，为探索RNAi用于抗病毒治疗的可能性及潜在靶点提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

幼仓鼠肾细胞(BHK21)购自美国ATCC保藏中心，由川北医学院病原中心实验室培养，采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，于37 ℃ 5% CO2条件下传代培养。JEV毒株SCYA201201(基因组序列，GenBank登录号为KU508409)由四川农业大学动物医学院提供，于川北医学院病原中心实验室保存，荧光定量PCR预混液购至宝生物工程有限公司。抗JEV E蛋白鼠源单克隆抗体，荧光素Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体购至Abcam生物技术有限公司。清洁级昆明雌鼠与昆明乳鼠由川北医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列设计与重组慢病毒的构建 通过对国内外23株具代表性的JEV毒株，进行全基因组序列比对，选定JEV的C、NS3、NS4A与NS5基因为靶点。运用线设计软件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)，设计出4条shRNA序列并合成。见表1。将shRNA序列与载体pGLVU6/RFP连接构建重组载体，并将重组载体与包装质粒共转染入人肾上皮细胞(293T)包装出携带shRNA序列的重组慢病毒，滴度>108TU/mL，此步骤由上海吉玛基因科技有限公司完成。阴性对照慢病毒LV-NC购自上海吉玛基因。

表1 靶基因与shRNA序列

1.2.2 慢病毒感染 待BHK21细胞在6孔板中铺满70%，用PBS洗涤两次后，将重组慢病毒按感染复数MOI=10接种细胞，每孔加入2 mL含10% FBS和5 μg/mL polybrene的DMEM培养液。置于37 ℃，5% CO2培养48 h后，用荧光显微镜观察红色荧光。

1.2.3 抑制JEV感染细胞 分别在感染重组慢病毒48 h、96 h后，按照感染复数MOI=0.1接种乙脑病毒SCYA201201株。病毒吸附1.5 h后，弃上清，每孔加入2 mL DMEM维持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培养72 h后，收毒做荧光定量RT-PCR与病毒滴度检测。另设实验组，接种JEV 48 h后，做间接免疫荧光检测。设阴性慢病毒LV-NC对照组、无慢病毒JEV攻毒组(Non-RNAi)与空白对照组(Mock)。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 待接种JEV 72 h后，收集细胞与上清，反复冻融3次，提取总RNA，并反转录成cDNA。采用25 μL荧光定量PCR体系：2 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR® Premix Ex TaqTMII、8.5 μL ddH2O、上游和下游引物各1 μL。定量PCR结果采用相对定量计算方法：以JEV E基因作为目标基因，BHK21细胞的GAPDH基因作为内参基因，运用2-△△Ct法计算JEV RNA的相对含量。见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.5 病毒滴度检测 待接种JEV 72 h后，反复冻融3次后，离心收集上清，作10倍梯度稀释后，加入铺满BHK21细胞的6孔板中，500 μL/孔。病毒吸附1.5 h后,弃上清，每孔加入2 mL含1%甲基纤维素的DMEM维持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培养5 d。去上清，用含2%甲醛的结晶紫染液染色15 min后，做蚀斑计数，计算病毒滴度。

1.2.6 间接免疫荧光检测 待接种JEV 48 h后，用PBS洗涤3次，依次进行固定、通透及封闭。加入500倍稀释的JEV E蛋白鼠源单克隆抗体，4 ℃孵育12 h。弃一抗，洗涤3次后，加入1 000倍稀释的荧光二抗，避光室温孵育45 min。避光洗涤3次后，用倒置荧光显微镜观察绿色荧光。

1.2.7 抑制JEV感染小鼠 (1)抑制乳鼠脑内的JEV增殖：将7 d龄乳鼠分为7组，每组5只。分别在攻毒前3 d和1 d，颅内注射2.5×105TU重组慢病毒。按5×LD50的剂量攻毒，颅内注射JEV SCYA201201株(LD50=1.02 log10 PFU)，5 d后处死，取脑组织制成10%组织悬液,反复冻融3次，离心收集上清，用0.22 μM滤膜过滤后，测定病毒滴度。(2)攻毒保护试验：将3周龄雌性昆明鼠分为7组，每组10只。分别在攻毒前3 d和1 d，颅内注射5×105TU重组慢病毒。按50×LD50的剂量攻毒，颅内注射JEV SCYA201201株(LD50=1.87 log10 PFU)，连续观察21 d，记录发病与死亡情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组慢病毒的构建与感染效率

感染重组慢病毒48～96 h后，6孔板中绝大多数细胞均呈现红色荧光，且各组间荧光强度与数量差异无统计学意义(P<0.05)。慢病毒感染组与空白对照组的细胞形态和增殖数量差异无统计学意义(P<0.05)，说明各重组慢病毒均能高效感染BHK21细胞，且对细胞无明显毒性。见图1。

2.2 对细胞中JEV增殖的抑制效果

荧光定量PCR结果显示，在48 h组中，相较于LV-NC(JEV RNA载量相对值=1)，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5分别使细胞中的JEV RNA载量降低89.7%、87.7%、74.6%和72.4%。96 h组与48 h相比，对JEV的抑制效果略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，证明重组慢病毒LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5均能显著抑制JEV在BHK21细胞中的增殖，且具有一定持续性，其中LV-C和LV-NS3的抑制效果强于LV-NS4A和LV-NS5(P<0.05)。病毒蚀斑实验显示，在48 h组中，相较于LV-NC对照组(107.51PFU/mL)，LV-C(104.43PFU/mL)、LV-NS3(104.79PFU/mL)、LV-NS4A(105.42PFU/mL)和LV-NS5(105.33PFU/mL)均使细胞中的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C与LV-NS3使病毒滴度分别降低了约1 200倍与525倍，96 h组的降低程度与48 h组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图3)，证明重组慢病毒能显著且持续抑制JEV在BHK21细胞中的增殖。间接免疫荧光检测显示，在荧光显微镜下，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5组的绿色荧光数量少于LV-NC对照组(P<0.05)，空白对照组无荧光出现，证明重组慢病毒显著抑制了细胞中的JEV增殖。见图2-图4。

2.3 对乳鼠脑内JEV增殖的抑制效果

乳鼠脑组织悬液中的病毒滴度检测显示，相较于LV-NC对照组(108.21PFU/mL)，LV-C(104.96PFU/mL)、LV-NS3(105.29PFU/mL)、LV-NS4A(105.82PFU/mL)和LV-NS5(105.68PFU/mL)均使乳鼠脑内的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C使病毒滴度降低了约1 700倍，证明重组慢病毒能显著抑制JEV在乳鼠脑内的增殖。见图5。

2.4 攻毒保护实验

3周龄小鼠攻毒保护实验显示，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A与LV-NS5组的存活率分别为70%、50%、60%、50%。LV-NC对照组全部死亡，空白对照组全部存活，证明重组慢病毒对3周龄小鼠具有较好保护作用。见图6。

3 讨论

JEV的基因组为单股正链RNA，其基因组即是复制模板，也行使mRNA功能。因此RNAi能同时抑制JEV基因组的复制和病毒蛋白的合成，具有机制上的优势。C基因具有较高的保守性，编码的C蛋白主要参与病毒的包装与核衣壳的形成[8]。NS3蛋白是具有丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的多功能蛋白，参与病毒蛋白的剪切与RNA复制。JEV复制时，细胞粗面内质网膜上会形成病毒RNA复制复合体，NS3蛋白和病毒RNA聚合酶NS5蛋白，作为复合体的核心组分，在JEV复制周期中起关键作用[9]。NS4A蛋白是NS3发挥蛋白酶活性的辅助因子，其还能通过诱导细胞自噬来促进病毒增殖[10-11]。

有研究[12-13]表明，靶向JEV的C、E和NS5基因的RNAi可有效抑制病毒感染细胞和小鼠，其中靶向E基因的RNAi表现出最强的抗病毒效果。为了探索新的抗病毒RNAi靶点及更系统地评估RNAi对JEV的抑制作用，本次选取C、NS3、NS4A与NS5基因，设计新的RNAi位点进行研究，结果显示，4个RNAi组均能明显抑制JEV对细胞和小鼠的感染(P<0.05)。其中LV-C组表现出最佳的抗病毒效果，使细胞中的病毒滴度降低约1 200倍，对3周龄小鼠的保护率达到70%。本研究分别在慢病毒感染细胞48 h和96 h后进行JEV接毒，结果显示96 h组与48 h组相比，抑制率差异无统计学意义(P>0.05)，仍保持高抗病毒活性。与之前采用质粒载体的研究相比[14]，其抗病毒的持续性有明显提升。本次动物实验，慢病毒没有出现致毒性，但观察期仅为21 d，因此要对安全性做出准确判断，还需更长期系统的研究。目前脱靶效应是RNAi技术面临的一个主要问题。为降低脱靶效应，可针对靶基因采用多位点联合沉默的方式来降低脱靶率[15]。因此本研究认为针对JEV多基因位点的联合RNAi可能会具有更佳的抗病毒效果，这有待进一步探索。

综上所述，以JEV的C、NS3、NS4A与NS5基因为靶点，由慢病毒介导的RNAi对病毒感染细胞和小鼠有显著抑制作用，其中靶向C基因的RNAi的抗病毒效果最强，其可能成为一种感染前的预防性治疗手段。由于本研究均在JEV感染前进行RNAi，因此其感染后的抗病毒效果还有待进一步研究。