何桂伦，易远名，杨奇慧，谭北平，迟淑艳，刘泓宇

广东海洋大学 水产学院/水产动物营养与饲料实验室，广东 湛江 524088

凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 具有生长快、养殖量大和成活率高等特点[1]，可在盐度1～50的水体环境中生活[2]。尽管凡纳滨对虾耐盐广，但水体盐度会对其生长与代谢产生重要影响，适宜的盐度可使其获得优良的生长发育和免疫能力[3]。已有研究报道凡纳滨对虾在盐度12[1]、17[4]或20左右[5-6]能获得优良的生长性能。由于凡纳滨对虾与水体环境间存在渗透压力差，在渗透压调节过程中面临着体内主要渗透压调节离子损失和营养物质需求量增加等问题[7]，因此高盐或低盐环境不仅会导致凡纳滨对虾渗透调节消耗更多的营养和能量[4]，还会导致其增重率、成活率[4]、抗逆性[8-9]和免疫力[9-10]下降等问题，低盐条件下易受氨氮[11]、副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticus)[12]和白斑综合征病毒 (WSSV)[13]等病原体的侵袭。前期研究表明，凡纳滨对虾在盐度3时的增重率和成活率较盐度17[4]和30[14]时低，对硼环境毒性敏感度高于盐度20[8]，盐度5时肝胰腺受损[15]，肌肉营养成分较正常盐度低[16]，血细胞免疫力较盐度20 时低[14]。

水产动物饲料不仅应提供动物体足够的营养和能量，还应具有缓解水产动物在环境变化时产生不良反应的活性物质。研究表明，盐度6时实验配方低蛋白质和高碳水化合物含量 (26%蛋白质和6%鱼粉加益生菌混合物) 能抵消部分低盐度带来的影响，提高凡纳滨对虾的成活率，提高其蛋白质效率和免疫力，而饲料蛋白质水平的升高 (40%粗蛋白质和20%鱼粉不含益生菌混合物) 并不能改善对虾的成活率[17]。肌醇既是一种与维生素H和维生素B1活性相似的营养因子[18]，对细胞膜的结构完整性和功能有重大影响[19]；也是一种重要的环境调节因子，主要以磷脂酰肌醇形式参与调节细胞对外部刺激的反应或神经传递并与各种特定蛋白质共同作用调节酶的活性[20]，进而调控动物体的生长及代谢[19-24]。前期研究表明，肌醇对水产动物肠道菌群和微环境调节具有重要作用[25]，饲料中添加肌醇能改善斑节对虾 (Penaeus monodon) 和幼建鲤 (Cyprinus carpiovarJian) 的肠道环境[26-27]，提高消化酶活性进而改善肠道消化吸收能力，使中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis) (肌醇水平 4 000 mg∙kg−1)[28]、斑节对虾 (肌醇水平 3 400 mg∙kg−1)[26]和盐度 17.4 的凡纳滨对虾 (肌醇水平 1 181.54 mg∙kg−1)获得良好的生长发育和免疫状况[29]。饲料中添加肌醇能增强凡纳滨对虾的抗氧化酶活性[30]，肌醇水平 110 mg∙kg−1能防止其出现明显的生长缓慢现象[29]。而饲料中缺乏肌醇不仅会减缓凡纳滨对虾、中国明对虾和斑节对虾的生长，对其发育和代谢产生不良影响，还会造成凡纳滨对虾和斑节对虾成活率明显降低[26,28-29]，致使建鲤幼鱼出现皮肤出血，鳞片脱落，皮肤、尾鳍和背鳍糜烂等症状[31]。

凡纳滨对虾的生长发育和免疫力与其体内mTOR蛋白信号通路中的TORC1相关因子有关，在环境因子或营养因子作用下此信号通路发生改变，进而影响其生长发育和免疫力[32-34]。低盐环境可能会对凡纳滨对虾的健康造成一定损害，肌醇作为环境和营养因子，可能会改善低盐条件下虾的生长、发育并提高其免疫力，但肌醇对低盐条件下凡纳滨对虾的生长、发育和代谢是否有促进作用尚未见报道。随着凡纳滨对虾在淡水或低盐条件下养殖面积与规模的增大，有关低盐度下凡纳滨对虾矿物元素[35]、维生素、饲料中蛋白质水平[7]、脂类营养[36]和糖类营养[37]的研究广泛。本研究通过分析对比盐度4和28条件下凡纳滨对虾的生长指标、体组成分、血清生化指标和非特异性免疫酶活性等，探讨了不同盐度下肌醇对凡纳滨对虾生长和代谢的影响，以为不同盐度水体养殖凡纳滨对虾提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计

以鱼粉、酪蛋白和明胶为蛋白源，豆油和鱼油为脂肪源，每千克基础饲料 (表1) 中分别添加0、100、200、400、800 和 1 600 mg 肌醇配制成 6 种等氮等脂饲料，分别标记为J0、J1、J2、J3、J4和J5组开展实验。计算并称量各原料，先过80目筛，再混合，加入适量的水揉匀，经双螺杆挤条机[华南理工大学研制的F-Ⅲ(26)型]制成颗粒状饲料 (粒径 1.0 和 1.5 mm) 后，置常压干燥箱 60 ℃熟化30 min，待温度降至室温后于避光通风处风干，用密封袋装封后置−20 ℃冰箱备用。

表1 实验饲料组成及营养水平 (干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(dry mass basis)

1.2 饲养管理

虾苗购自湛江市中联养殖有限公司，于广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地标粗4 周至实验所需规格后，挑选健康的虾于室内虾养殖系统开展养殖实验。选取体质量为 (0.75±0.03) g的凡纳滨对虾幼虾，每个处理组设3个重复，共12个处理，在每个0.3 m3的玻璃纤维桶中放养40尾。每天按虾体质量的8%～10%称料，于07:00、11:00和16:00和20:00投喂，其中早晚投饵量各占一天投饵量的30%～35%，投喂30 min后观察并记录摄食情况，根据天气条件和摄食情况对投喂量进行调整。实验周期共10周，养殖水体盐度分别为4 (L)和28(H)。根据饲料和盐度的不同组合，J0投喂对照组饲料，J1、J2、J3、J4和J5分别为添加100、200、400、800 和 1 600 mg∙kg−1肌醇饲料的实验组；L 为盐度4的养殖水体条件，H为盐度28的养殖水体条件，将12个处理组分别命名为LJ0、LJ1、LJ2、LJ3、LJ4、LJ5、HJ0、HJ1、HJ2、HJ3、HJ4、HJ5。实验期间水中持续充氧，水温28.6～31.4 ℃，氨氮质量浓度<0.03 mg∙L−1，水体溶解氧质量浓度>6.8 mg∙L−1，pH 7.8～8.2。

1.3 生长指标和体成分测定

实验结束后，对桶内的对虾进行称质量和计数，每个重复随机选取5尾分析全虾体成分，按李日美[38]的方法测定水分、粗灰分、粗蛋白质和粗脂肪。另选取5尾取出肝胰腺后称质量，计算肝体比。

1.4 血清指标及酶活测定

每个重复取5尾虾，按李日美[38]方法处理，备测血清中总胆固醇 (Total cholesterol, TC)、甘油三酯 (Triglyceride, TG)、总蛋白 (Total protein, TP)和葡萄糖 (Glucose, Glu)；冰上取出5尾虾的肝胰腺，按李日美[38]方法处理，用于肝胰腺酸性磷酸酶 (Acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, AKP)、总超氧化物歧化酶 (Total superoxide dismutase, T-SOD) 和一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS) 活性测定。上述指标检测试剂盒均来自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明书进行实验操作。

1.5 数据统计分析

用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据以“平均值±标准差 (SD)”表示，采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，若单因素各组间平均数差异显著则采用Duncan's多重比较法，若交互因素作用显著，则对单个因素的平均值进行Duncan's多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准。增重率 (Weight gain rate, WGR)、成活率 (Survival rate, SR)、饲料系数 (Feed coefficient, FC)、特定生长率 (Special growth rate, SGR)、蛋白质效率 (Protein efficiency ratio, PER)、肝体比 (Hepatopancreas somatic indices, HSI)、蛋白质净利用率 (Net protein utilization, NPU) 等指标计算公式如下：

式中：Wt为终末体质量；W0为初始体质量；nt为实验结束时虾尾数；n0实验开始时放虾尾数；M为摄食饲料干物质质量；m0为平均初始体质量；mt为平均终末体质量；mi为蛋白质摄入量；Wh为肝胰腺质量；m为虾体质量；t为实验天数；MS为氮沉积量；MN为氮摄入量。

2 结果

2.1 肌醇对凡纳滨对虾生长和饲料利用的影响

肌醇对凡纳滨对虾幼虾生长和饲料利用有显著影响 (P<0.05，表2)。盐度4条件下，各肌醇添加组的终末体质量、增重率、特定生长率和蛋白质效率均显著高于对照组 (P<0.05)，LJ2、LJ3、LJ4和LJ5组的成活率显著高于对照组 (P<0.05)，随着肌醇水平的升高呈上升趋势，饲料系数反之，肌醇水平 1 600 mg∙kg−1的饲料系数最低，其余指标反之。LJ0组的终末体质量、增重率、成活率、特定生长率和蛋白质效率显著低于HJ0组 (P<0.05)，饲料系数反之，饲料中添加 100 mg∙kg−1肌醇组各指标与HL0组无显著差异(P>0.05)。盐度28条件下，各肌醇添加组的成活率、特定生长率和蛋白质效率显著高于对照组(P<0.05)，HJ2、HJ3、HJ4和HJ5组的终末体质量、增重率显著高于对照组，随着肌醇水平的升高呈上升趋势，饲料系数反之，肌醇水平1 600 mg∙kg−1的饲料系数最低，其余指标反之。盐度 28 条件下投喂肌醇水平 100 mg∙kg−1的凡纳滨对虾成活率和蛋白质效率显著高于盐度4 (P<0.05)，200、400、800 和 1 600 mg∙kg−1的终末体质量、增重率、特定生长率和蛋白质效率显著高于盐度4(P<0.05)。双因素方差分析显示，盐度和肌醇对终末体质量、增重率、成活率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率有显著影响 (P<0.05)，盐度和肌醇的交互作用对终末体质量、增重率、成活率、特定生长率、饲料系数有显著影响 (P<0.05)。

表2 肌醇对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响Table 2 Effects of inositol on growth performance for juvenile L. vannamei

2.2 肌醇对凡纳滨对虾体组成成分的影响

肌醇对凡纳滨对虾体组成成分有显著影响(P<0.05，表3)。盐度28的水分低于盐度4，而NPU反之。HSI随着肌醇水平的升高先升后降，在肌醇水平 800 mg∙kg−1的达到最大值；NPU 随肌醇水平的增加呈上升趋势，在肌醇水平 1 600 mg∙kg−1时达到最高。双因素方差分析显示，盐度对水分、NPU有显著影响(P<0.05)，肌醇水平对HSI和NPU有显著影响 (P<0.05)，盐度和肌醇水平的交互作用对HIS、水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分和NPU无显著影响 (P>0.05)。

表3 肌醇对凡纳滨对虾幼虾体成分的影响 (干物质基础)Table 3 Effects of inositol on body composition for juvenile L. vannamei (dry matter basis)

2.3 肌醇对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

肌醇对凡纳滨对虾血清生化指标有显著影响(P<0.05，表4)。两种盐度条件下，随着肌醇水平升高 TC 含量呈下降趋势，在 1 600 mg∙kg−1时最低，均显著低于对照组 (P<0.05)。盐度28肌醇水平 400 mg∙kg−1组的 TC含量显著高于盐度 4(P<0.05)。双因素方差分析显示，盐度和肌醇水平对TC含量有显著影响 (P<0.05)。盐度和肌醇水平的交互作用对TP、TG、TC和Glu含量无显著影响 (P>0.05)。

表4 肌醇对凡纳滨对虾幼虾血清生化指标影响Table 4 Effects of inositol on serum biochemical indexes for juvenile L. vannamei

2.4 肌醇对凡纳滨对虾肝胰腺非特异性免疫酶活的影响

肌醇对凡纳滨对虾肝胰腺非特异性免疫酶活有显著影响 (P<0.05，表5)。盐度4条件下，投喂肌醇 200、400 和 800 mg∙kg−1组的 ACP 活性无显著差异 (P>0.05)，但显著高于对照组 (P<0.05)，200 mg∙kg−1组的活性最高。AKP 活性随肌醇水平的升高呈上升趋势，200、400、800 和 1 600 mg∙kg−1组显著高于对照组 (P<0.05)，且 1 600 mg∙kg−1组显著高于其他组 (P<0.05)；投喂肌醇对T-SOD和NOS活性无显著影响 (P>0.05)。盐度28条件下，各肌醇添加组的ACP活性显著高于对照组 (P<0.05)，随肌醇水平的升高，ACP活性呈先升后降趋势，400 与 200 mg∙kg−1组无显著差异 (P>0.05)，且ACP 活性最高。投喂 100 mg∙kg−1肌醇组的 AKP 活性显著高于其他组 (P<0.05)；投喂200、400、800 和 1 600 mg∙kg−1肌醇组的 T-SOD 活性显著高于对照组 (P<0.05)，400 mg∙kg−1组显著高于其他组 (P<0.05)。NOS活性随肌醇水平的升高呈先升后降的趋势，200、400 和 800 mg∙kg−1组显著高于对照组(P<0.05)，400 mg∙kg−1组显著高于其他组 (P<0.05)。LJ0组的AKP和NOS活性显著低于HJ0组 (P<0.05)。盐度 4 条件下饲料中添加肌醇 1 600 mg∙kg−1(LJ5组)可使凡纳滨对虾的AKP、T-SOD和NOS活性与HJ0组无显著差异 (P>0.05)，ACP活性显著高于HJ0组 (P<0.05)。双因素方差分析显示，盐度对ACP、AKP、T-SOD和NOS有显著影响 (P<0.05)，肌醇水平对ACP、AKP和NOS有显著影响(P<0.05)，盐度和肌醇水平的交互作用对AKP、TSOD和NOS有显著影响 (P<0.05)。

表5 肌醇对凡纳滨对虾幼虾部分非特异性免疫酶活的影响Table 5 Effects of inositol on some non-specific immunoenzyme activities for juvenile L. vannamei

3 讨论

水生动物的生长受水体环境和饲料等因素的影响，良好的水体环境和饲料是其取得优良生长状况的重要保障。饲料系数反映了饲料利用率，饲料系数越低，说明饲料转化率越高，饲喂效果越好。本研究中，盐度和肌醇对终末体质量、增重率、成活率、特定生长率和饲料系数的影响存在交互作用，饲料中添加肌醇可显著提高不同盐度下凡纳滨对虾的上述指标，但对不同盐度下虾的促生长作用效果不同。在盐度 28 下投喂 800 或 1 600 mg∙kg−1肌醇可使虾的终末体质量、增重率、特定生长率达到最高水平，投喂 1 600 mg∙kg−1肌醇饲料系数达到最低水平，投喂不低于 100 mg∙kg−1肌醇或盐度 4 投喂不低于 200 mg∙kg−1肌醇成活率达到最高水平，而1 600 mg∙kg−1肌醇组终末体质量、增重率、成活率和特定生长率最大，饲料系数最小，表明肌醇能促进不同盐度下虾的生长、发育且实现了饲料的高效利用，且高盐度更优。这与Chen等[30]饲料中添加肌醇可促进凡纳滨对虾生长的研究结果一致，后者报道了肌醇水平高于 1 568 mg∙kg−1不会进一步提高虾的生长性能。凡纳滨对虾在渗透压调节过程中的能量主要由蛋白质提供[37]，不同盐度下对蛋白质的需求量不同。研究发现，在盐度2和28的环境中，凡纳滨对虾的最适蛋白质需求量分别为26.7%和33.0%[37]。本研究中，饲料蛋白质水平为40.0%(鱼粉16.00%)，饲料中添加肌醇降低了饲料系数，提高了凡纳滨对虾对饲料营养成分的利用，增强了其自身蛋白质的生成和贮存能力，且低盐条件和高肌醇水平下这种作用更明显，表明肌醇有利于低盐度养殖凡纳滨对虾正常生长状态的恢复，但具体的作用机制需测定相关基因后进一步验证分析。

ACP、AKP、T-SOD和NOS是重要的非特异性免疫酶指标。AKP和ACP参与细胞调控周期中蛋白 (酶) 的去磷酸化阶段[39]，在生物体免疫反应时可以催化磷酸酯类物质水解生成无机磷酸并伴随促进ATP的生成[40]。有研究表明，水产动物在面对外界不良环境变化如低盐或盐度骤变时体内AKP和ACP的活性均受到抑制[41-42]，这与腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 有关，在渗透压调节过程中，凡纳滨对虾体内AMPK通过激活ATP产生途径和阻断ATP消耗来管理过量的能量消耗[43]。有研究指出盐度3较盐度30的AMPK转录和蛋白质水平高[43]。本研究中，盐度和肌醇对AKP、T-SOD和NOS活性的影响存在交互作用，饲料中添加肌醇提高了AKP活性，盐度28且肌醇水平 100 mg∙kg−1时，AKP 活性最高。在饲料中添加肌醇有利于凡纳滨对虾中AKP和ACP活性的增强[44-45]，饲料中肌醇水平为 600 mg∙kg−1时，血淋巴中AKP活性最高[30]；中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)摄食肌醇水平为 1 650 mg∙kg−1时，血清中AKP 活性最高[46]；因此，投喂 100 mg∙kg−1肌醇正常盐度养殖凡纳滨对虾有利于提高其非特异性免疫力。T-SOD是机体内清除氧自由基的酶类，可反映机体的抗氧化能力[38]。本研究中，盐度28且肌醇水平 400 mg∙kg−1时 T-SOD 活性最高，说明投喂100 mg∙kg−1肌醇、正常盐度养殖凡纳滨对虾有利于提高其抗氧化能力。NOS是体现动物健康的一个重要指标，是生物体内合成一氧化氮 (NO) 过程中的关键酶，可作用于病原体的核酸生物体内，催化产生的NO具有杀灭细菌、病毒和寄生虫等作用[12]，其活性受脂质代谢、细胞内钙离子或信号传导的影响[47]。有研究指出，HcNOS具有高度保守性，是典型的无脊椎NOS，可能是应对细菌感染和组织移植的关键角色[43]。本研究中，盐度28、肌醇水平 400 mg∙kg−1时 NOS 活性最高，说明饲料中添加适量肌醇有利于提高凡纳滨对虾对氨氮环境的适应能力，这与Chen等[44]的研究结果一致(肌醇水平介于 459.7～993.8 mg∙kg−1时，凡纳滨对虾可适应总氨氮质量浓度为 60.21 mg∙L−1的环境)。

4 结论

凡纳滨对虾幼虾的生长和肝胰腺非特异性免疫指标随摄食肌醇的剂量和盐度不同而呈不同的变化趋势。盐度可显著影响其生长和非特异性免疫指标，各指标最大值出现在28盐度组。肌醇和盐度对凡纳滨对虾的各生长指标和AKP、T-SOD、NOS活性的影响存在交互作用，饲料中添加肌醇可促进凡纳滨对虾的生长发育，提高其成活率和非特异性免疫力；饲料中添加肌醇介于800～1 600 mg∙kg−1时能使两种盐度条件下凡纳滨对虾均获得最佳的生长发育和成活率；盐度28条件下，饲料中肌醇水平为 100 或 400 mg∙kg−1时，虾可获得良好的非特异性免疫力；盐度4条件下，凡纳滨对虾的生长和非特异性免疫力受到抑制，饲料中肌醇水平不低于200 mg∙kg−1可在一定程度上提高其免疫力。