陈晓雷，李 敏，陈作志，张 俊，张 帅，齐占会，徐姗楠

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部外海渔业可持续利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300

2. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306

3. 南方海洋科学与工程广东省实验室 (广州)，广东 广州 511458

灯笼鱼是栖息于中层海域 (200～1 000 m) 的小型游泳鱼类，广泛分布于全球各大洋开阔海域，是中层鱼的主要生物类群，其资源量巨大，约占全球深海中层鱼类生物量的65%[1]。灯笼鱼在摄食浮游生物的同时又被更高营养级生物 (如大中型鱼类)所捕食，在海洋食物网的能量流动和转换中发挥着重要作用[2]。

亮眶灯鱼 (Diaphus splendidus) 隶属于灯笼鱼科、眶灯鱼属，是灯笼鱼的主要优势种之一。食性研究是鱼类生物学和生态学研究的重要内容，是了解不同鱼类间营养关系的基础，同时也是探讨摄食策略、评估鱼类生存状况和生态系统功能的重要依据[3]。目前，国外对灯笼鱼食性研究的相关报道按照区域划分有太平洋[4-6]、大西洋[7-8]、印度洋[9]、阿拉伯海[10]及南大洋[11-12]等。国内对灯笼鱼摄食方面的研究也有陆续报道，如东海和黄海海域的七星底灯鱼 (Benthosema pterotum)[13]，南海海域的金鼻眶灯鱼 (D. chrysorhynchus)[14]、瓦氏眶灯鱼(D. watasei)[15]等。已有研究显示，灯笼鱼的食物组成主要以桡足类、介形类、端足类、磷虾类、翼足类、毛颌类等浮游动物为主，也有少量的头足类和鱼类幼体及其卵，采用的研究方法多为形态学鉴定。胃含物形态学鉴定虽然操作简单，但针对消化程度较高、腐烂程度较严重的胃含物则难以鉴定甚至无法鉴定[16-17]，从而可能低估了食物多样性，不适于个体较小生物的食性分析[18]，且工作量大，对鉴定人员专业技术能力要求高[17]。

宏条形码技术结合DNA条形码和高通量测序技术，将样本中所有生物作为一个整体提取DNA，使用通用引物进行PCR扩增，对扩增产物进行高通量测序后得到的可操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTU) 进行物种鉴定[19]，具有信息量大、灵敏度高、成效快、成本低等优势，在生物食性研究的应用上越来越广泛[20]。近年来，该技术已应用于鱼类、翼足类和水母等海洋生物的摄食多样性研究[21-24]，弥补了形态学鉴定方法在鉴别消化程度较高、腐烂程度较严重的胃含物方面的不足。

目前，尚未有使用宏条形码技术研究南海灯笼鱼食性的报道。本研究选取南海亮眶灯鱼为研究对象，运用宏条形码技术分析其食性组成，探讨宏条形码技术在灯笼鱼食性研究中的可行性，为今后南海灯笼鱼食性研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 样品采集

亮眶灯鱼样本由中国水产科学研究院南海水产研究所“南锋”号调查船于2020年7月在南海(110°22.603'E, 16°46.704'N—110°25.950'E,16°44.952'N) 进行中层鱼类拖网中采集。该船总长66.66 m，船宽 12.40 m，总吨位 1 537 GT，满载排水量1 980 t，主机功率 1 920 kW，副机功率 450 kW×2。采样点位置水深为1 350 m，使用中层网 (主尺度为 136. 10 m×50. 85 m，网囊网目尺寸为 10 mm)于 500 m 水深平行拖网 1 h，拖速为3.1 kn。采集的样品经鉴定后于−20 ℃保存，带回实验室后于−80 ℃ 保存。

1.2 样品处理

待鱼体解冻后，随机挑选亮眶灯鱼8尾，用滤纸吸干鱼体表面水分后进行生物学测定(图1)，样品的生物学信息见表1。各项测定指标参照GB/T 12763.6—2007《海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查》，主要包括体长、体质量和摄食强度等。亮眶灯鱼的摄食强度使用目测法进行鉴定，分为5级 (0～4级)，分别对应空胃，胃内有少量食物且体积不超过胃腔的1/2，胃内食物较多且体积超过胃腔的1/2，胃内充满食物但胃壁不膨胀和胃内食物饱满、胃壁膨胀变薄5种状态。鉴定完毕后将亮眶灯鱼的全部胃含物 (包括胃内黏液) 放入离心管中进行DNA提取。

图1 南海亮眶灯鱼与其胃含物Fig. 1 D. splendidus of South China Sea andits stomach contents

表1 亮眶灯鱼生物学信息Table 1 Sampling information of D. splendidus

由于拖网时灯笼鱼形态受损，依据形态特征鉴定较为困难，为确保物种鉴定的准确性，同时取背部肌肉用于分子鉴定。为避免实验过程中的交叉污染，严格按照无污染操作进行实验。

1.3 DNA 提取与扩增

使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根) 按照其说明书进行总DNA提取。DNA浓度和质量使用超微量分光光度计测量，经检验合格后，进行PCR扩增。

肌肉DNA使用鱼类通用引物FishF1和FishR1[25](表2) 对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI) 区域进行PCR扩增，片段大小为655 bp。扩增总体系为 25 μL：1.1×PCR Mix 22 μL (擎科生物)，正反引物 (5 μmol·L−1) 各 1 μL，DNA 模板 1 μL。扩增程序如下：98 ℃ 预变性 2 min；98 ℃ 变性10 s，55 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 12 s，共 35 个循环；72 ℃延伸4 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检验合格后送至测序公司测序。

表2 亮眶灯鱼肌肉和胃含物种类鉴定的PCR引物Table 2 PCR primers for species identification of muscle and stomach contents of D. splendidus

胃含物DNA使用通用引物mlCOIintF和jgHCO2198[26-27](表2) 对 COI基因高变区进行扩增，扩增片段大小约为313 bp。扩增总体系为50 μL：10×High Fidelity PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol·L−1) 2 μL，TaKaRaTaq酶 0.2 μL，MgSO4(25 mmol·L−1) 4 μL，ddH2O 35.8 μL，含有 barcode 的正反引物 (5 μmol·L−1) 各 1 μL，DNA 模板1 μL。由于引物简并碱基较多，简并性较高，所以采用冷启动降落PCR程序尽可能地减少非特异扩增。PCR程序为：95 ℃预变性3 min；16个降落循环 (95 ℃ 变性 10 s，62 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min)，每个循环退火温度下降1 ℃；25个普通循环 (95 ℃ 变性 10 s，46 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min)；72 ℃ 延伸 4 min。PCR 产物通过 2% 琼脂糖凝胶电泳检测，送至上海生工进行高通量测序。DNA提取和PCR扩增均使用ddH2O做阴性对照，所有的阴性对照均无目的条带，表明实验过程中无污染产生。

1.4 数据处理

肌肉序列使用BLAST与GenBank数据库 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行比对，若两者序列相似度≥97%，则认为可以鉴定到种水平[22]，即为亮眶灯鱼。

通过 Illumina Miseq 2×300 bp 测序平台 (Illumina，美国) 双端测序得到下机数据，去除引物接头序列，根据PE reads之间的重叠关系，将成对的读长拼接成一条序列，然后按照标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据进行质控过滤，得到各样本的有效序列。应用Usearch(11.0.667)[28]软件对有效序列按照97%的序列相似度进行聚类得到OTU，选择OTU代表序列使用BLAST 与 NCBI NT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库比对进行物种注释并人工校对，筛选出序列的最佳比对结果。若满足序列相似度 (per. identity)≥97%，则认为鉴定到种水平；若满足序列相似度90%～97%，则认为鉴定到属水平[29-30]，不满足条件的序列则被归为未分类。通过OTU分析可得出胃含物组成的多样性和不同物种的相对丰度 (Relative abundance，即单个物种的序列数/总序列数)。

2 结果

2.1 分类地位鉴定

肌肉样本的分子鉴定结果显示，除了LK-3外其余样本与形态学鉴定结果一致，均是亮眶灯鱼(LK-3序列相似度<97%，仅鉴定到眶灯鱼属，做舍弃处理)。

胃含物样本共获得长度约为313 bp的序列138 414条，剔除亮眶灯鱼的自身序列、未分类序列以及丰度较低的序列后，共获得14 533条序列。按照97%相似性聚类后得到34条OTU代表序列，注释得到34种饵料生物 (表3)，分属于5门7纲11目18科29属，其中有79.41%的OTU鉴定到种水平。

表3 亮眶灯鱼胃含物组成Table 3 Stomach contents of D. splendidus

2.2 胃含物组成

根据亮眶灯鱼胃含物的相对丰度显示 (图2)，介形虫纲占比最高 (79.12%)，其次是甲壳纲(11.28%)，其余纲占比如下：软甲纲 4.03%、水螅纲 2.66%、辐鳍亚纲 1.94%、腹足纲 0.81%、多毛纲 0.16%。从饵料种类数量来看，辐鳍亚纲的生物种类最多，共11种，甲壳纲和介形虫纲均为7种，软甲纲和腹足纲均为3种，水螅纲2种，多毛纲1种。

图2 亮眶灯鱼胃含物相对丰度组成百分比 (纲水平)Fig. 2 Relative abundance proportion of stomach contents for D. splendidus (class level)

根据物种序列丰度百分比显示 (表3)，排在前三位的种类分别是胖海浮萤 (Halocypris inflata)、茗荷属和武装片戎 (Vibilia armata)，合计占亮眶灯鱼饵料生物相对丰度的91.1%。从种类数量上分析，鱼类、桡足类和介形类是亮眶灯鱼重要的食物组成，分别有11、7和7种，占总数量的82.35%。此外还检测到3种翼足类：Clio pyramidata、Diacria major和驼龟螺；2种水母类：棍手水母属(Rhopalonemasp.) 和Botrynemasp.；1 种磷虾类：拟遂足磷虾(Thysanopoda aequalis)；1种十足类：莫氏硬壳寄居蟹 (Calcinus morgani)；1 种多毛类：叶须虫属 (Phyllodocesp. 11BIOAK-1 631)。

3 讨论

3.1 亮眶灯鱼的食物组成特征

研究物种的食性特征，首先要确定其食物组成结构。本次研究共鉴定出34种饵料生物，分属于9大类群。从亮眶灯鱼的食物种类组成分析，浮游甲壳动物是其主要的摄食对象，包括桡足类、介形类、磷虾类、端足类以及十足类，共17种，占总种类数量的50%；其中桡足类和介形类为绝对优势类群，共14种，种类数占41.2%。龚玉艳等[14]利用传统形态学方法研究金鼻眶灯鱼的食性时，同样发现食物组成中的浮游甲壳动物占绝对优势，其中桡足类的种类数量最多，占总种类数量的68.38%；因此推测浮游甲壳动物是眶灯鱼属灯笼鱼的主要摄食对象。此外，仅从生物类群来看，鱼类的种类数最多，共11种，占总种类数量的32.35%，因此，鱼类也是亮眶灯鱼的重要食物组成。根据龚玉艳等[14]的研究结果，灯笼鱼捕食的鱼类多为仔稚鱼或灯笼鱼科幼鱼[14]。从亮眶灯鱼的食物序列丰度分析，同样是浮游甲壳动物的序列丰度最高，占总序列丰度的95.5%，其中胖海浮萤所占比列最高(77.71%)，其次是茗荷属物种 (9.83%) 和武装片戎(3.56%)，结果表明胖海浮萤是介形类生物中的优势饵料生物。Clarke等[31]使用宏条形码技术对4种裸灯鱼属灯笼鱼的食性研究结果显示，甲壳类浮游动物的序列占总饵料生物序列的90%以上，因此推测甲壳类浮游动物是灯笼鱼的主要摄食类群。

水母是浮游动物群落中的一类常见物种，在各大海域广泛分布。本研究从亮眶灯鱼胃含物中检测出棍手水母属和Botrynemasp.两种水母。同样，Clarke等[31]利用宏条形码技术在后鳍裸灯鱼 (Gymnoscopelus opisthopterus) 的胃含物中检测出水母。然而，以往的食性的报道中[13-15,32]并未鉴定出水母这一食物类群，可能因为水母及其幼体形态差异小且消化程度高而难以鉴别，因此被忽略或归为不可辨认类别。例如在解剖亮眶灯鱼的胃部时发现其胃含物多为食糜状态，难以用形态学方法鉴定(图1)。而宏条形码技术不依赖形态学特征，可利用高度降解、片段小的DNA以发掘更多物种信息[21]，因此宏条形码技术可作为传统形态学鉴定方法的潜在应用工具，运用于灯笼鱼的食性研究。

此外，本研究与利用形态学鉴定方法对南海海域灯笼鱼食性组成的研究做了对比 (表4)，结果显示共同检测到的食物类群包括介形类、桡足类、端足类、鱼类和磷虾类，说明这5大类是南海灯笼鱼的重要食物来源。另外，从检测的饵料生物种类数量来看，两项研究结果差异较大，本研究鉴定出34种饵料生物，龚玉艳等[14]鉴定出117种饵料生物 (其中包括未鉴定到种及不可辨认种类)，可能原因如下：1) 本研究的样本量较小 (7 尾 vs 50 尾)；2)本研究中亮眶灯鱼的摄食强度位于1～2级间，胃含物呈食糜状态，而龚玉艳等[14]研究中金鼻眶灯鱼的摄食强度普遍较高 (3～4级占72%)。摄食强度的差异由样本采集时间不同所致，摄食强度高的样本包含更多的食物组成信息，因此能够检测到更多的饵料生物。同时，由于采集灯笼鱼的种类、水域、季节不同，其结果也可能存在差异。

3.2 饵料的生物学特征

鱼类的食性特征受到饵料生物种类及其分布的影响，浮游动物作为亮眶灯鱼的主要食物类群，其种类组成和数量分布对亮眶灯鱼的摄食习性有着重要影响。龚玉艳等[33]对南海浮游动物群落的空间分布研究结果显示，桡足类、端足类、介形类、水母类为主要生物类群，本研究中检测到的亮眶灯鱼的主要食物类群与该研究基本一致。此外，灯笼鱼具有明显的昼夜垂直迁移习性，白天一般栖息于300～700 m水层，晚上则游至200 m以浅觅食[9,34-35]，这一特征与浮游动物的分布密切相关[36]。浮游动物具有明显的垂直分层现象，该现象受其昼夜垂直迁移影响导致浮游动物在水层中分布不均，使得生物的种类和丰度总体随水深的增加而减少，即0～200 m水层生物种类最丰富，600～750 m水层最贫乏。因此推断，捕食时随饵料生物迁移是灯笼鱼昼夜垂直迁移的原因之一。

3.3 宏条形码技术的不足

宏条形码技术在鱼类食性研究中的应用越来越广泛，但也存在一些不容忽视的局限性。如无法区分鱼类自身序列的具体来源、PCR扩增偏向性等，这可能导致一些丰度低的食物类群无法被鉴定出来，使得获取的食物组成信息不够完整。

本研究所获得的序列中亮眶灯鱼自身序列占88.33%，如此高的自身序列比例很难确定具体来源，推测主要与亮眶灯鱼自身DNA的干扰、同类自食行为以及同类基因碎片有关。亮眶灯鱼自身DNA的干扰主要来源于胃液中，在提取胃含物总DNA时一并提取出来，后经PCR扩增不断放大。关于灯笼鱼的同类自食行为已有研究证实，如瓦氏眶灯鱼是一种比较凶猛的肉食性中层鱼，在捕食时偶尔会摄食同类[15]。金海卫等[13]在利用形态学方法鉴定七星底灯鱼的食物组成时发现其胃含物中有同类残骸，因此推测亮眶灯鱼同种之间也存在自食行为，从而在胃含物中检测到同类的DNA。同类基因碎片 (如同类的皮肤碎片、黏膜、唾液和粪便等) 主要来源于亮眶灯鱼栖息的水体中，这些碎片可能在亮眶灯鱼进食过程中带到胃内，从而被扩增出来。目前，为了去除自身序列的干扰，最简便且常用的方法是将测序结果中含有目标物种本身的序列剔除[21-23]，更优化的方法是通过设计阻断引物以阻止自身序列的扩增[37-38]。

鱼类胃含物是包含多种生物模板的混合体，由于不同模板与引物的结合程度不同，在PCR扩增中，其扩增效率也不同，扩增效率高的模板很可能会对扩增效率低的产生抑制作用，导致PCR受到抑制的食物类群被低估甚至无法鉴别[20]。因此，选择合适的引物、增加实验重复以及测序深度，对提高物种的检出率有很大作用[39]。

由于本研究的样本量有限，仅作为利用宏条形码技术对亮眶灯鱼食性组成的初步探究，在今后的研究中将增加样本量并分析不同时空分布灯笼鱼的食性组成和特征。本研究结果表明宏条形码技术作为灯笼鱼食性分析的有效工具，显示出了良好的食性鉴别潜力，尤其是难以通过形态学鉴定的鱼类食性研究。