苏贤 李艳宏 阎少多

肝脏是人体内极其重要而独特的器官，具有强大的再生能力，在肝损伤甚至部分肝切除的情况下仍能恢复正常的生理功能和体积。临床治疗中，部分肝切除被认为是多种肝脏肿瘤的重要治疗方式，而当发生肝硬化、代谢性肝病等严重肝损伤疾病造成肝功能失代偿时，肝移植往往是唯一有效的治疗方式。肝切除和肝移植手术能否取得成功，很大程度上取决于肝脏的再生和肝功能的恢复。虽然，肝脏相关手术治疗技术取得了巨大进步，但肝切除术或活体肝移植术后的肝再生失败或肝功能障碍，仍然是关乎病患生存率的重大问题。肝脏再生功能的维持，主要依赖于肝组织内细胞损伤/再生的动态平衡调控，而其确切的细胞与分子生物学机制仍存在众多盲点亟待阐明。

1 肝再生 肝脏再生是由多型细胞连续增殖和多种细胞因子精准调控的生物学进程[1]。当肝脏受到损伤时，肝实质细胞首先进入细胞分裂周期进行增殖，同时，其产生有丝分裂信号促进肝内其他类型的细胞增殖。最新研究结果显示，位于肝小叶中间区的成熟肝实质细胞是整个肝脏中制造新细胞的主要贡献者[2-3]。尔后，多种类型的肝内细胞，如胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）、肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）等启动增殖。肝脏细胞的增殖还受到各种转录激活因子、细胞因子等的协同调控，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等转录激活因子，细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）等蛋白激酶，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素6（interleukin-6，IL-6） 等细胞因子，均对肝再生进程产生重要影响[1，4-5]。

2 血小板与肝再生 血小板是成熟巨核细胞脱落的小块无核胞质碎片，内含线粒体、高尔基体、内质网等细胞器结构，并含有α颗粒、致密颗粒、溶酶体颗粒等分泌颗粒，其是血液成分中普遍存在却又极为重要的有形组分[6-7]。血小板的主要生理学功能是止血、凝血和修补破损血管：血小板激活后可在血管破损处发生聚集并释放活性物质，进而参与止血、凝血等过程。同时，大量研究证据显示，血小板的生理学功能不仅限于止血与凝血，其在组织修复再生、机体炎症反应、肿瘤的形成与转移、机体免疫应答等多种病理生理过程中均发挥非常重要的作用[8-10]。

血小板与肝组织间的关系非常密切。血小板内含有与肝脏生理功能相关的多种细胞因子，包括血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、转化生长因子β（transforming growth factor-β ，TGF-β）、HGF、EGF等[7，11]。严重肝脏疾病患者常伴有一定程度的血小板数量减少或质量异常。此时，血小板异常大多是由于肝脏功能紊乱或免疫因素导致的，并非独立疾病，但需要通过治疗或预防性血小板输注予以纠正。同时，血小板也可在肝损伤、切除（移植）等刺激因素的作用下，通过激活并释放生物活性物质发挥正向调控功能。研究表明，绝大多数的肝再生相关生长因子都储存在血小板中，血小板是肝切除术后肝再生的有效诱导因子，肝切除术后血小板活化和颗粒释放增加在肝再生进程中发挥重要生理作用[12-14]。

3 血小板促进肝再生 1984年，NAKAMURA等人首次从大鼠血小板中纯化出HGF，并证实它对肝细胞DNA合成具有强烈的刺激作用，随后PDGF和TGF-β也被证实是血小板诱导肝再生的重要调节因子[12，15]。HISAKURA等人发现，肝切除术后，在血小板增多的情况下，肝脏中胆汁淤积、肿胀和坏死程度减轻[16]。动物实验结果显示，多种因素导致的血小板增多促进了肝切除术后的肝细胞增殖。例如，70%肝切除术后，使用促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）诱导血小板计数增加可使小鼠肝重/体重比、肝细胞增殖能力增加，加速肝切除术后的肝再生[17，19]。直接输注血小板也可增加肝切除术后鼠的肝重/体重比与肝细胞增殖能力，促进肝再生[20-21]。通过TPO诱导血小板增多，甚至可促进90%肝切除术后小鼠的肝脏再生，并增加小鼠存活率[22]。LOPEZ等人用海藻酸钠微囊化血小板，并植入90%肝切除术大鼠的腹膜，同样证实了血小板增加组的大鼠存活率更高[23]。此外，血小板增加也可使部分肝移植术后大鼠肝脏/体重比、肝细胞增殖能力增强，加速移植术后的肝再生[24]。而使用抑制血小板功能的化疗药或抗血小板抗体诱导血小板减少后，肝再生受到显著抑制[17]。

临床数据证实，肝切除或活体供肝移植术后的低血小板计数与术后肝功能障碍、高病死率等不良结局相关[25-28]。MARGONIS等人通过CT容积分析法直接评估肝再生情况，发现低血小板组在肝切除术后2个月内肝体积的相对增加要低得多[29]。接受肝切除术的患者，术后即刻低血小板计数或血小板计数下降超40%的患者术后肝功能更差，血清肝损伤标志物更高，病死率更高[26-27]。另外，输注血小板能促进活体供肝移植受者的肝再生[30]。因此，部分肝切除术围手术期低血小板与肝切除术后较高的肝衰竭和病死率相关，是延迟肝功能恢复和术后并发症的独立危险因素。

3.1 血小板与肝脏细胞

3.1.1 肝实质细胞：肝脏是一个高度血管化的器官，肝损伤后，血小板立即在肝组织中积聚[31-33]。研究表明，肝损伤时，在IL-1、TNF-α等的作用下，血小板积极向窦周腔转移[31，34]，而窦周腔是肝实质细胞与血窦内皮细胞之间的狭窄间隙，正常情况下血小板不会出现在其中。肝切除术后的数分钟内，即可在小鼠体内观察到血小板在残肝中的积聚[35]。透射电镜显示，血小板从肝窦腔向窦周腔迁移，促使血小板与肝实质细胞直接接触[17，20，22]（图1）。此外，有研究发现，血小板与肝实质细胞的直接接触和继发的肝实质细胞去唾液酸糖蛋白受体（ashwell-morell receptor，AMR）介导的血小板吞噬，可触发血小板可溶性因子的释放，促进肝实质细胞增殖[13，31，36-37]。STARLINGER等在临床中也有类似的发现，肝切除术后2 h内，血小板即在肝组织中积聚[14]。但尚未有临床证据证实肝切除术后血小板与肝细胞的直接接触导致生长因子的释放。

3.1.2 肝窦内皮细胞：LSECs是肝脏组织中一种重要的非实质细胞，是肝窦壁的基本组成细胞，在肝实质和血液之间形成连续的结构屏障。肝窦壁有开放的毛细孔或无隔膜的窗孔和基底层，使循环外周血与肝实质细胞接触，促进各种可溶性大分子和颗粒的交换。研究结果显示，在受损的肝组织中，血小板可粘附于免疫细胞和LSECs[33，38]。进一步研究证实，LSECs和血小板间的相互作用显著影响了小鼠部分肝切除术后的肝再生进程[39-40]。血小板黏附在LSECs上可导致血小板活化，随之导致血小板颗粒的释放，刺激肝细胞增殖。同时，血小板可释放转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）激活LSECs，导致IL-6分泌，促进肝实质细胞DNA合成，进一步促进肝细胞增殖和肝再生[38，40-42]（图1）。此外，也有研究发现，血小板与LSECs直接接触触发血小板分泌鞘氨醇1-磷酸（sphingosine 1-phosphate，S1P），进而诱导LSECs分泌IL-6，促进肝细胞增殖[40]。

图1 血小板介导的肝再生

3.1.3 枯否细胞：MURATA等证实，枯否细胞（Kupffer cell）耗竭后，小鼠部分肝切除术后肝重/体重比、肝细胞增殖指数、有丝分裂指数等均下降，肝再生延迟[18]。Kupffer细胞是肝组织中TNF-α、IL-6等的重要来源，同时，Kupffer细胞还能产生IGF-1、HGF等生长因子[18，43]。肝切除术后，Kupffer细胞耗竭的小鼠肝组织中TNF-α、IL-6等的浓度无法快速增加，肝再生受到明显抑制[44]。进一步研究发现，肝切除术后肝窦周腔内的血小板附着于Kupffer细胞表面，而未接受肝切除术则相对较少[21]。因此，肝切除术后，激活的Kupffer细胞诱导血小板在肝脏中积聚，并促使血小板附着于其表面，进一步被其吞噬或激活并随之导致血小板颗粒的释放。血小板与Kupffer细胞间的相互作用，进一步增强了Kupffer细胞的功能[21，45]，并促使其产生TNF-α、IL-6等促进肝再生（图1）。而Kupffer细胞耗竭，则显著减少血小板在肝组织中的积聚和迁移，进而对肝再生产生负面影响[31]。此外，有研究表明，肝切除术后，胶囊化血小板与Kupffer细胞相互作用，可通过降低氧化应激反应，减少肝细胞凋亡[46]。

3.2 血小板与信号通路：肝再生进程受到IL-6、HGF、EGF等的调控，各种细胞因子在肝脏细胞中活化并激活下游信号分子，最终激活细胞周期蛋白促使肝内细胞由静止状态向细胞周期过渡[47-48]。目前，已知能促进肝细胞由静止期进入细胞周期的信号通路有PI3K/Akt（蛋白激酶B）通路、IL-6/STAT3通路、ERK1/2通路、HGF/c-Met（HGF受体）通路、TNF-α/NF-κB通路、5-HT（血清素）/小G蛋白通路等[7，49]。而大量证据显示，血小板可通过促进以上信号通路的级联反应刺激肝脏细胞的增殖，进而参与肝再生进程（图1）。

3.2.1 PI3K/Akt信号通路：PI3K/Akt信号通路可被肝组织中的HGF、IGF-1等细胞因子激活[18，50]，MURATA等发现，肝切除术后6 h内，血小板增加组小鼠的糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）被强烈激活，而血小板减少组小鼠的GSK-3β磷酸化降低[17]。GSK-3β的磷酸化可进一步诱导肝实质细胞DNA合成，其被认为是PI3k/Akt通路重要的下游响应分子[51]。因此，血小板可通过PI3k/Akt信号通路影响肝再生进程。进一步研究发现，肝切除引发的肝内血小板聚集，可使Akt信号通路更早、更强、更持久地激活[22，52]。而肝实质细胞膜表面的血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）缺失，则可导致肝切除术后早期PI3k/Akt的激活受损，肝再生延迟[53-54]。通过PI3K抑制剂LY294002抑制PI3k/Akt通路激活，也可显著减弱血小板促进肝细胞增殖的作用[13]。此外，有研究发现，肝移植术后，血小板增多组大鼠的肝脏总Akt磷酸化水平明显升高，并进一步对肝移植术后的肝再生产生影响[24]。上述结果提示PI3K/Akt通路是血小板促进肝再生的重要信号通路之一。

3.2.2 ERK1/2信号通路：ERK1/2信号通路由生长因子激活，参与各类细胞的生长、增殖与分化。肝切除术后，ERK1/2信号通路被即刻激活，且其往往与PI3K/Akt通路同时被激活，并在肝再生过程中发挥重要作用[20，24，55]。体外研究证实，HGF、IGF-1和VEGF是ERK1/2信号通路的强刺激因子，并可促进肝实质细胞的增殖，而这些激活因子的产生和分泌均与血小板密切相关[13]。此外，血小板在肝组织内聚集，可诱导LSECs的增殖，并通过活化ERK1/2信号通路诱导LSECs分泌IL-6、VEGF和IGF-1等细胞因子，进一步促进肝再生[40]。

3.2.3 IL-6/STAT3信号通路：众所周知，IL-6/STAT3信号通路是肝再生的重要信号通路之一，激活该通路可以促进肝实质细胞生长、增殖并预防凋亡[56]。IL-6/IL-6受体复合物（interleukin-6/interleukin-6 receptor，IL-6/IL-6R）与糖蛋白130（glycoprotein 130，Gp130）结合，可启动STAT3通路，从而刺激肝细胞增殖。而IL-6或STAT3敲除的转基因小鼠，在肝切除术后肝细胞的增殖被抑制[57-59]。有研究证实，在血小板增多的情况下STAT3可以更早地激活，且其磷酸化水平显著升高[17-18，22，24]，而特异性的缺失血小板活化受体C-型凝集素受体-2（c-type lectin-like receptor2，CLEC-2）小鼠肝组织中IL-6的表达和STAT3的磷酸化以及肝再生均受到抑制。上述结果表明，IL-6/STAT3信号通路在血小板相关肝再生的生理机制中发挥着关键作用。同时，近年来IL-6反式信号转导（interleukin-6transsignaling）在肝再生中的作用受到广泛关注[60]。IL-6反式信号是指金属蛋白酶裂解IL-6R形成可溶性IL-6R（soluble IL-6R，sIL-6R），其能与IL-6结合并激活Gp130。MODARES等的研究结果表明，IL-6反式信号而非经典信号途径控制着肝切除术后的肝再生过程[61]。此外，有研究表明，肝切除术后，IL-6反式信号通过与生长因子协同，通过PI3K/Akt依赖机制促进肝实质细胞进入细胞周期[62]。目前，尚无直接证据表明经典的IL-6/STAT3信号通路和IL-6反式信号转导哪一信号在肝再生中占据主要作用。

3.2.4 HGF/c-Met信号通路：c-Met是肝实质细胞表面与HGF结合的酪氨酸激酶受体之一，HGF/c-Met信号可激活PI3K，随后磷酸化Akt，从而促进肝实质细胞增殖[50，63]。c-Met的缺失或阻断HGF/c-Met通路会抑制肝再生[64-65]。c-Met被证实在肝切除术后1 h内被酪氨酸激酶磷酸化并迅速激活。研究表明，血小板数量增加可使c-Met磷酸化增强，且持续时间更长[22]。肝实质细胞表面PDGFRα的缺失，可导致肝切除术后ERK和Akt激活受损，而这一损失可通过EGFR和c-Met的代偿性表达弥补，进而维持Akt的活化状态，保证部分肝切除小鼠在肝再生中晚期肝实质细胞的正常增殖[53-54]。

3.2.5 TNF-α/NF-κB信号通路：TNF-α是肝再生启动的关键因子之一。TNF-α刺激NF-κB转录因子，诱导细胞周期蛋白D1表达和G1/S期的转换，参与肝细胞增殖[66]。有研究显示，NF-κB在肝切除术后30 min内激活，持续时间通常不超过4～5 h[67-68]。使用TNF-a抗体、TNF敲除或TNFR1敲除小鼠，肝切除术后肝再生显著延迟[59，69-71]。同时，使用NF-κB激活抑制剂，小鼠肝切除术后肝再生受到抑制[72]。此外，有研究表明，部分肝移植术后，血小板增多组的大鼠肝脏中NF-κB的磷酸化水平明显升高[24]。已知Kupffer细胞产生的TNF-α是肝脏中TNF-α的重要来源，而血小板与Kupffer细胞间的相互作用促进了TNF-α的释放。因此，TNF-α/NF-κB通路在血小板促进肝细胞增殖中发挥着一定的作用。

3.2.6 5-HT/小G蛋白通路：2006年，LESURTEL等首先报道了5-HT对肝再生的促进作用，在循环5-HT缺乏的小鼠体内，肝再生延迟，而血小板致密颗粒中存储的大量5-HT可能是肝再生的关键因素之一[73-74]。研究证实，血小板减少小鼠部分肝切除术后，在5-HT激动剂的作用下，5-HT直接参与对肝细胞增殖的诱导，促进肝再生。STARLINGER等进一步研究证实，由血小板致密颗粒释放的5-HT，是肝切除术后肝再生的关键诱因[75-76]。5-HT通过与小G蛋白结合来调控下游生理活动，而小G蛋白可与多种下游途径相连接，包括PI3K/Akt、ERK1/2和IL-6/STAT3等，进而促进肝再生[77-78]。例如，CHANG等发现，5-HT通过STAT3信号通路促进肝细胞增殖，通过Akt信号通路影响肝细胞增殖与凋亡[79]。FANG等的研究结果显示，ERK信号通路的激活是5-HT促进肝细胞增殖和细胞周期进展的重要因素[80]。

3.3 血小板RNA：虽然血小板无核，但血小板中除含有大量细胞因子外，还含有约8500种编码RNA（mRNA）和约500种非编码RNA（microRNAs，miRNA）。血小板可将其内含的大量RNA转移至肝实质细胞，通过mRNA的翻译或非编码RNA的调控作用于肝细胞（图1）。有研究证实，在小鼠部分肝切除术后，被肝实质细胞内化的血小板可将其RNA转移到肝实质细胞的胞质中，这可能是血小板促进肝细胞增殖的又一重要机制[81]。

然而，目前尚缺乏系统深入的研究结论来明确证实血小板相关RNA在肝细胞增殖中的作用。由于研究结果报道较少，究竟哪些RNA参与了血小板促进肝细胞增殖过程尚未完全清楚。已有相关研究结果证实，MiR-21、MiR-23b、MiR-221等可促进肝细胞的增殖，而MiR-33、MiR-378等则可抑制肝细胞的增殖，而血小板中含有上述miRNA。此外，血小板相关RNA调节肝细胞增殖的作用最终仍是通过细胞间相互作用和信号分子传导等来具体实现的[82-83]。

4 总结与展望 大量的基础研究和临床数据提示，通过血小板诱导肝再生可能是针对接受部分肝切除术、活体肝移植术等患者的一种新的辅助治疗策略。严重肝脏疾病与外周血循环中血小板的数量密切相关：针对符合预防性输注适应证的病患，如体内血小板数量过低或肝脏手术前血小板数量较低等，必须先调整外周血循环中血小板的数量才能进一步治疗；针对符合治疗性输注适应证的病患，如严重肝病导致的血小板功能异常等，必须适时予以血小板治疗性输注，防止出血。因此，有学者提出严重肝病的“血小板疗法”，特别是针对肝切除（移植）术后并发肝衰竭、早期同种异体移植物功能障碍等的患者，合理的术前（中）血小板输注，除起到了调节外周血循环中血小板数量与功能的生理作用外，还将充分激活肝细胞相关信号通路，增加肝组织中细胞因子的合成分泌，促进肝内细胞增殖，对肝脏组织修复再生起到重要调控作用。

通过合理的血小板输注可达到减少手术处置风险、增强术后康复效果的作用，同时也增加了血栓形成风险。因此，血小板输注在肝再生治疗中是一把双刃剑。在应用以血小板输注为基础的治疗时，还应严格考虑合理的输注策略以尽可能放大有益效果，减少危害可能。近年，血小板衍生物等血小板生物替代技术得到广泛应用。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、血小板裂解液（platelet lysates，PL）等均已在临床治疗或基础研究领域应用。血小板衍生物的应用，为在不增加血栓形成风险的前提下，通过血小板促进肝组织修复再生提供了新的思路。然而，现阶段，血小板衍生物的临床应用主要是自体采集后局部注射。富血小板血浆等在被大范围应用于同种异体临床输注前，必须完成可靠的动物实验和规范的人群试验，而这些严格的规范要求限值了血小板衍生物大规模临床应用的快速进展。

未来，大量深入的研究工作仍需在进一步明确血小板及其衍生物与肝再生间的相互作用关系等方面努力，通过更加深入、系统的基础实验和临床数据来支撑“血小板疗法”这一新的辅助治疗策略，为严重肝脏疾病患者创造更加丰富、有效的临床救治手段。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突