鲁大鹏 王保龙

肝细胞癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，是世界上最常见的恶性肿瘤之一，手术切除、肝移植和射频消融术是治疗HCC的主要方法[1-3]。肝癌发病隐匿，早期症状一般不明显，发现时多数已是晚期；其恶性程度高，根治性治疗后患者的复发率仍然较高，其5年生存率仅为18%，是仅次于胰腺癌的第二大致死肿瘤[4-6]。尤其在中国，肝癌患者的前景更加严峻，5年生存率低至12%[7]。因此，

寻找和探索除甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP） 以外的肝癌早期诊断、疗效观察的肿瘤标志物极为重要。miRNAs是一类含有19～22个核苷酸的小非编码RNA，在转录后水平调控靶基因表达[8]。大量研究表明，miRNAs广泛参与肝癌的增殖、凋亡、迁移与侵袭、耐药等发生发展过程，是肝癌早期诊断的重要指标之一。近期报道显示与肝良性病变相比，肝癌患者血清中的7种miRNAs（包括miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192，miR-223，和miR-801）简称miRNA7，表达水平均具有显著的差异，调控肝癌细胞活性，对肝癌早期诊断有一定的指导作用，具有作为HCC早期诊断标志物的潜力[9-13]。另外，研究表明联合检测血清中miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192，miR-223，miR-801可以准确地区分肝癌患者和健康人群，即使在AFP阴性肝癌患者中仍能较准确地区分两类人群[14]。因此，联合检测miRNA7对肝癌患者的早期诊断具有重要的临床意义。

本研究对HCC患者血清中miRNA7、AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平进行检测，探讨三者联合检测在肝癌早期诊断中的应用价值。

资料与方法

1 一般资料 收集2020年6月～2022年1月于中国科技大学附属第一医院进行诊治的75例原发性肝癌患者（肝恶性组）、70例非癌性患者（肝良性组）、以及32例健康体检者（对照组），进行血清miRNA7、AFP、CEA含量检测。肝恶性组中男性65例，女性10例；年龄24～79岁，平均（57.88±10.88）岁。纳入标准：① HCC诊断标准：符合《原发性肝癌诊疗规范（ 2017 年版） 》[15]诊断标准；②临床诊断和病理诊断均经影像学及病理组织学确诊；③所有肝癌患者采血前均未进行手术、放化疗等治疗。排除标准：①存在严重心血管疾病、精神疾病的患者; ②酒精性肝硬化；③伴其他部位肿瘤者;④近期服用影响检测指标结果的药物者。肝良性组包括20例肝炎，35例肝硬化，10例肝囊肿和5例肝血管瘤，其中男性52例，女性18例；年龄35～84岁，平均（56.44±1.74）岁。对照组为健康体检者，其中男性26例，女性6例；年龄29～76岁，平均（52.8±11.1）岁。肝恶性组、良性组以及对照组性别、年龄相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2 方法 采集入选者空腹静脉血4 mL，3 500 r/min转速，离心10 min后收集上层血清，于-20 ℃ 冰箱冻存。PCR荧光探针法测定血浆miRNA7的总相对定量值Logit（Logit =-1.944 9+0.106 33×dCtmiR-21+0.102 19×dCtmiR-26a-0.012 441×dCtmiR-27a-0.289 02×dCtmiR-122-0.327 79×dCtmiR-192+ 0.258 55×dCtmiR-223-0.029 515×dCtmiR-801），仪器为荧光定量PCR仪（ABI 7500型号），试剂为骏实生物公司提供，按其试剂盒步骤检测；化学发光免疫分析法测定血清肿瘤标志物AFP、CEA含量，仪器为罗氏免疫分析仪Cobas 8000，试剂由罗氏公司提供。

3 评价指标 ①检索miRNAs相关数据库ENCORI： The Encyclopedia of RNA Interactomes. （starbase.sysu.edu.cn/index.php），评估miRNA7在肝癌组织中的表达水平；②检测三组血清中miRNA7、AFP和CEA含量；③检测三组血清中miRNA7、AFP和CEA阳性率；④通过构建入选者特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线 ，计算血清miRNA7、AFP和CEA单项检测及联合检测诊断肝癌的曲线下面积（area under the curve，AUC） 。正常参考范围：miRNA7＜-0.5，AFP≤7 ng/mL，CEA≤5 ng/mL。

4 统计学方法 采用GraphPad 8.0统计软件分析数据。血清miRNA7、AFP和CEA水平为计量资料，采用（±s）表示，比较行t检验; 检测阳性率为计数资料，比较行χ2检验，AUC值分析行Z检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 miRNA7在肝组织中的表达 MiRNAs相关数据库ENCORI包含了50例肝正常组织和370例肝癌组织的相关数据信息。检索相关miRNA7数据显示，相比于肝正常组织，肝癌组织中miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122， miR-192和miR-223均显著异常表达，且差异均有统计学意义（P＜0.05）（miR-801相关研究较少，故数据库未统计），见图1。

图1 ENCORI数据库中miRNA7在肝正常组织和HCC组织中的表达差异分析

2 三组血清miRNA7、AFP、CEA水平比较 分别检测入院时三组患者血清miRNA7、AFP和CEA的表达水平，表2结果显示肝恶性组织中miRNA7的总相对定量值Logit、AFP和CEA水平均显著高于肝良性组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 三组血清miRNA7、AFP、CEA水平比较（±s）

表2 三组血清miRNA7、AFP、CEA水平比较（±s）

注：*P＜0.05。

3 三组血清miRNA7、AFP、CEA检测阳性率比较 肝恶性组血清miRNA7、AFP、CEA检测阳性率显著高于肝良性组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 三组血清miRNA7、AFP、CEA检测阳性率比较[n（%）]

4 血清miRNA7、AFP、CEA单独检测及联合检测的ROC曲线下面积（AUC）分析 构建肝恶性组和对照组间的ROC曲线（见图2A），血清miRNA7、AFP、CEA联合检测的AUC值为0.97，显著高于三者单独检测，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表4）；同时，构建肝恶性组和良性组间的ROC曲线（见图2B），三者联合检测的AUC值为0.92，也显著高于miRNA7、AFP、CEA单独检测，其与AFP、CEA间差异均有统计学意义（P＜0.01），但与miRNA7间差异无统计学意义（P＞0.05，见表5）。结果表明血清miRNA7与AFP、CEA联合检测，可提高肝癌患者与健康者间早期筛查诊断效能。在肝恶性和良性病变早期鉴别诊断中，miRNA7单独检测具有较好的临床诊断价值，与AFP、CEA联合检测并不能有效提高早期筛查能力。

图2 血清miRNA7、AFP、CEA单独检测及联合检测诊断HCC的ROC曲线

表4 肝恶性组和对照组中血清miRNA7、AFP、CEA单独检测及联合检测的ROC曲线下面积（AUC）分析

表5 肝恶性组和良性组中血清miRNA7、AFP、CEA单独检测及联合检测的ROC曲线下 面积（AUC）分析

讨 论

肝癌是世界上常见的消化系统恶性肿瘤，每年新增病例超过78.2万例，也是癌症死亡的第二大原因，每年可导致74.6万例癌症死亡，其中一半发生在中国，是种极其致命的疾病[16-17]。目前临床诊断主要依靠影像学检查、病理活检和实验室指标检测三种方式，相比于其他两种，实验室指标检测不仅能更好地对疾病进展进行诊断，而且不会对患者机体造成损伤、取材简便、诊疗费用更低，更适用于肝癌的早发现、早诊断和早治疗方针。

甲胎蛋白（AFP）主要由卵黄囊及肝细胞合成，在新生儿出生1岁后，其含量逐渐降低，正常成人AFP含量较低，若肝细胞发生癌变，机体血清AFP含量会显著异常升高，但部分研究[18]表明，AFP诊断的假阳性率较高，诊断效能并不理想。癌胚抗原（CEA）是一种肿瘤相关抗原，主要经胃肠道代谢，故正常成人血清CEA含量较低，而肝癌患者可分泌大量CEA进入血液循环，导致血清CEA明显升高。同时，大量研究表明，胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、甲状腺癌以及心血管疾病等患者血清CEA含量均不同程度地升高[19-20]。因此，亟需新的血清肿瘤标志物促进肝癌的早期诊断和预后疗效判断。

临床试验表明，血清miRNAs含量的变化与肝癌的发生发展密切相关。研究发现[21]，高表达miR-21的肝癌患者血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）表达增加，而白蛋白（ALB）表达减低，上调miR-21可通过抑制SMAD7蛋白促进肝癌细胞的增殖和迁移，且能提高肝癌患者的早期诊断和预后判断能力。ZHU等[22]研究团队发现，在肝癌组织（或细胞）中，miR-26a-5p表达异常降低，降低水平与肿瘤直径、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移相关。MiR-26a-5p可直接靶向HMGA2抑制肝癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。miR-26a-5p的异常降低及其靶蛋白HMGA2的升高可能参与HCC发生发展的重要因素，miR-26a-5p可能是肝癌早期诊断和治疗的潜在新靶点。循环miRNAs是稳定、无创的肿瘤诊断生物标志物，以外泌体等形式存在于血清中，在癌症的大规模筛查或早期检测中有很大的价值[23-24]。研究表明，血清miR-21、miR-122和miR-223在HCC或慢性肝炎患者中显著升高，是区分HCC或慢性肝炎患者与健康对照组的有用标志物[12]。然而，慢性肝炎患者血清miR-21和miR-122高于HCC，miR-223无显著差异，仅仅这3种miRNAs可能对区分HCC和慢性肝炎患者无效。因此，需结合多种miRNAs，才能有效鉴别肝癌。本研究中，我们检索了7种miRNAs（包括miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192， miR-223，和miR-801）在数据库ENCORI的生物信息发现，相比于肝正常组织，肝癌组织多种miRNAs的表达水平均发生显著变化，提示miRNA7具有作为肝癌早期诊断血清标志物的潜力。为此我们收集了75例肝恶性病变者、70例肝良性病变者以及32例健康体检者，检测受试者血清miRNA7、AFP和CEA含量。结果显示相比于健康对照组及肝良性组，肝恶性组血清miRNA7、AFP和CEA的表达水平及阳性率均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），进一步证实血清miRNA7肿瘤标志物在肝癌患者的异常变化，对疾病的早期诊断具有重要价值。肝恶性组和对照组的ROC曲线显示，血清miRNA7、AFP和CEA联合检测的AUC值明显高于三者单独检测，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明三者联合检测可提高早期肝癌的诊断效能，为临床肝癌早期诊断提供参考。另外，本研究在构建肝恶性组和良性组间ROC曲线时发现，血清miRNA7、AFP和CEA联合检测的AUC值也均高于单独检测，三者联合检测的AUC值与AFP、CEA间差异有统计学意义（P＜0.05），但与miRNA7间差异无统计学意义（P＞0.05）。由于本研究纳入病例数有限，血清miRNA7与AFP、CEA在肝癌、肝良性病变以及健康者间早期诊断效能评估仍需更多研究验证。

综上所述，血清标志物miRNA7含量的检测，有利于早期肝癌诊断的有效评估，且与AFP、CEA联合检测进一步提高早期肝癌的诊断效能，降低高危人群恶性肿瘤致死率，为肝癌患者的预后疗效判断提供新的方向和手段。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突