王 亮， 韦继光， 葛春峰， 於 虹， 姜燕琴， 杨曙方， 曾其龙， 田亮亮，①

〔1. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)， 江苏 南京 210014； 2. 浙江蓝美技术股份有限公司， 浙江 绍兴 312000〕

蓝莓(Vacciniumspp.)为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(VacciniumLinn.)落叶灌木，其果实中花青素含量较高，具有保护视力和增强人体免疫力等功效[1-3]。蓝莓原产北美，杂交育种是其品种培育的主要手段。目前，科研工作者已经选育出一批品质优良的品种[4-6]，并从生理特性[7]和化学成分[8]等方面对蓝莓进行了研究，促进了蓝莓产业的发展。但是，目前绝大多数蓝莓品种对中国的黏重土壤和夏季高温适应性较差，不能达到高产稳产；且国内现有引进栽培品种的遗传多样性较低、遗传基础较狭窄[9-11]，应该加强野生资源在育种中的利用。中国越橘属种质资源丰富，特有种有51种[12]，但缺少可以直接利用的品种，特别是现有栽培品种所属的蓝浆果组(Sect．Cyanococcus)在中国没有分布。因此，除了引进野生资源，在现有栽培品种中发掘遗传背景相对复杂的品种为育种材料，开展针对中国生态特点的育种工作对中国蓝莓的产业化具有重要意义。

蓝莓品种‘蓝美1号’(Vacciniumcorymbosum‘Lanmei 1’)是目前国内利用引进育种材料选育出的惟一一个国家级林木良种(编号：国R-ETS-VC-006-2018)，该品种源自20世纪90年代引入的美国蓝莓育种体系的育种资源，是复杂的种间杂交实生子代，除了蓝莓品种常含有的遗传基础外，还含有常绿越橘(V.darrowiiCamp)和依利越橘(V.elliottiiChapm.)的遗传基础[13]。该品种既继承了野生越橘抗旱、耐热和耐瘠薄的优点，对中国长江流域黏重土壤和夏季高温有较好的适应性，又有野生越橘的高级保健功能，果实花青素含量高[14]，是良好的加工品种。因此，充分开发利用‘蓝美1号’的抗性基因资源，对中国蓝莓种质资源创新具有重要意义。

SSR(simple sequence repeats)标记是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，具有良好的保守性、多态性高、共显性等优点，且实验过程中所需样本量少、分辨率高、可重复性强[15]。目前，SSR标记在蓝莓遗传多样性、亲缘关系、指纹图谱构建以及群体遗传结构等方面得到广泛应用，如：崔建民等[9]利用22对SSR引物，明确了93份蓝莓材料的亲缘关系，发现现有栽培品种遗传多样性较低，遗传基础狭窄；刘有春等[10]采用EST-SSR标记对越橘属84份材料的群体遗传结构进行了分析，发现大多数蓝莓品种的遗传背景较单一；徐国辉等[16]利用SSR分子标记技术鉴定了蓝莓优良品系的父本，并通过2对引物构建了8个蓝莓优良品系的指纹图谱；张春红等[17]利用25对SSR引物对66个蓝莓品种进行了分析，揭示了不同栽培类型蓝莓种质的差异。

本研究以‘蓝美1号’217个自由授粉子代为研究材料，采用SSR分子标记分析自由授粉子代的遗传多样性和群体遗传结构，以期为‘蓝美1号’自由授粉子代选育、评价及育种工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为‘蓝美1号’217个自由授粉子代和26个现有蓝莓栽培品种，共243份材料。‘蓝美1号’217个自由授粉子代由浙江省诸暨市青山村青山基地苗圃(东经120.07°、北纬29.65°，海拔103 m)中‘蓝美1号’自由授粉获得的种实经播种育苗后得到，子代种植于青山基地苗圃，苗圃周围无其他蓝莓品种存在。26个品种包括：‘粉蓝’(‘Powderblue’)、‘巨丰’(‘Delite’)、‘园蓝’(‘Gardenblue’)、‘精华’(‘Choice’)和‘奥斯汀’(‘Austin’)5个兔眼蓝莓品种；‘绿宝石’(‘Emerald’)、‘春高’(‘Springhigh’)、‘奥尼尔’(‘O’Neal’)、‘阳光蓝’(‘Sunshine Blue’)、‘薄雾’(‘Misty’)、‘夏普蓝’(‘Sharpblue’)、‘明星’(‘Star’)、‘珠宝’(‘Jewel’)和‘库帕’(‘Cooper’)9个南高丛蓝莓品种；‘日出’(‘Sunrise’)、‘蓝金’(‘Bluegold’)、‘康维尔’(‘Coville’)、‘公爵’(‘Duke’)、‘伯克利’(‘Berkeley’)、‘齐佩瓦’(‘Chippewa’)、‘布里吉塔’(‘Brigitta’)、‘达柔’(‘Darrow’)、‘钱德勒’(‘Chandler’)、‘莱格西’(‘Legacy’)、‘晚蓝’(‘Lateblue’)和‘蓝丰’(‘Bluecrop’)12个北高丛蓝莓品种。26个品种均种植于江苏省中国科学院植物研究所苗圃(东经118.84°、北纬32.06°，海拔30 m)。于2020年5月，采集217个自由授粉子代单株和26个品种新梢顶端刚长出的嫩叶，每株采集3～5枚，置于-80 ℃冰箱保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用AG501C新型植物基因组DNA提取试剂盒(上海浦迪生物科技有限公司)提取217个自由授粉子代和26个品种植株叶片的基因组DNA，用质量体积分数1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用Berthold Colibri超微量分光光度计(德国Berthold Technology公司)测定DNA的浓度和纯度，置于-20 ℃冰箱中保存、备用。

1.2.2 SSR引物的扩增筛选 用TC1000-G PCR仪(美国Scilogex公司)进行PCR扩增反应。PCR扩增体系总体积10.0 μL，包括50 ng·μL-1DNA 1.0 μL、2×3GTaqMaster Mix for PAGE (Red Dye)混合液5.0 μL、100 μmol·L-1上游和下游引物各0.1 μL以及ddH2O 3.8 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后，在质量体积分数8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用质量体积分数0.2%AgNO3染色后置于灯箱上拍照。从200对SSR引物中，筛选出23对多态性好的引物用于供试材料基因组DNA的PCR扩增，根据条带扩增情况进行统计分析。

1.3 数据处理和分析

1.3.1 遗传多样性分析 记录引物的多态性位点，某一位点上有条带记为“1”，无条带记为“0”，使用EXCEL 2013软件构建“1”“0”矩阵。基于多态性条带，使用POPGENE软件计算Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s多态性信息指数；使用PIC-CALC软件计算各引物的多态性信息含量指数(PIC)，PIC值越高，表明SSR分子标记的多态性越丰富，PIC>0.50表示引物有高度多态性[18,19]；使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行UPGMA聚类分析。

1.3.2 群体遗传结构分析 参照黄宇宁[20]的方法，使用STRUCTURE 2.3.4软件对217个自由授粉子代进行群体遗传结构分析，分组数(K)设置为2～10，每个K值重复运算10次，100 000次马尔科夫链蒙特卡罗(MC)重复之后进行100 000次burn-in，使用STRUCTURE Harvester在线工具[21]对获得的结果进行分析。参照Evanno等[22]的方法，用ΔK确定合适的K值。ΔK为|L″(K)|的平均数除以L′(K)的标准差，其中L′(K)=L(K)-L(K-1)，|L″(K)|=|L′(K+1)-L′(K)|，L(K)是STRUCTURE 2.3.4运行结果中的最大似然值对数lnP(K)。使用CLUMPP 2.0软件[23]将运算结果合并，绘制群体遗传结构分析图。计算各子代相应的Qi值(各子代归入某一亚群的概率，i为子代所属亚群)，对子代的遗传背景进行分析，其中，Qi≥0.6表示遗传来源单一，Qi<0.6表示具有混合遗传来源[24,25]。

2 结果和分析

2.1 扩增结果及遗传多样性分析

基于SSR引物扩增结果，‘蓝美1号’217个自由授粉子代和26个蓝莓品种的遗传多样性分析结果见表1。结果显示：23对引物在243个供试材料中共检测出113个等位基因，等位基因数均值为4.9，其中，引物FLS-3和GVC-C179_213扩增出的等位基因数最多(8)，引物CHI-2、KAN-1007、KAN-2133、KAN-453和KAN-628扩增出的等位基因数最少(3)；有效等位基因数(Ne)为2.6～6.7，均值为4.4；多态性信息含量指数(PIC)为0.507 5～0.833 0，均值为0.686 6。23对引物的PIC值均在0.5以上，表明筛选出的SSR引物的多态性高，其中引物FLS-3、GVC-C179_213、GVC-C66a_306、KAN-2584和PrO32475744b的PIC值均高于0.8。

217个自由授粉子代的Nei’s遗传多样性指数(H)为0.591 1～0.850 9，均值为0.733 4；Shannon’s 多态性信息指数(I)为0.968 5～1.978 9，均值为1.439 4。26个品种的H值为0.195 8～0.813 0，均值为0.479 1；I值为0.346 5～1.728 0，均值为0.851 8。217个自由授粉子代的H和I值均大于26个品种，表明自由授粉子代群体存在丰富的遗传多样性，且遗传多样性优于现有栽培品种。

表1 供试SSR引物的扩增结果及‘蓝美1号’217个自由授粉子代和26个蓝莓品种的遗传多样性分析1)

2.2 聚类分析

根据各材料间的遗传相似系数，对‘蓝美1号’217个自由授粉子代和26个蓝莓品种进行聚类分析，使用1～217对217个自由授粉子代进行编号，结果见图1。结果显示：243个供试材料的遗传相似系数为0.58～0.99，在遗传相似系数0.58处，217个自由授粉子代与26个品种被明显分为2大类，表明‘蓝美1号’自由授粉子代同现有蓝莓栽培品种亲缘关系较远。217个自由授粉子代的遗传相似系数为0.70～0.99，相似程度较高。217个自由授粉子代可聚为5个类群，其中，除编号1、15、49、50、56、59、65、113、124和168外，其余207个子代分为3类：编号2、3、9、10、16、26、27、29、34、37、38、41、61、62、64、67、69、71、73、75、77、83、89、93、94、97、99、105、107、109、112、114、115、119、128、133、143、155、160、162、170、172、181、186、193、194、196、207、208、209、210、213和214共53个子代聚为类群Ⅱ，编号11、13、21、40、118、122、123、129、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、178、179、182、183和211共32个子代聚为类群Ⅳ，其余122个子代聚为类群Ⅰ。

2.3 群体遗传结构分析

用STRUCTURE 2.3.4软件分析‘蓝美1号’217个自由授粉子代的群体遗传结构，结果(图2-A)显示：当K=4时，ΔK出现峰值，此时各亚群内相似性最大；且K=4时，217个自由授粉子代的群体遗传结构聚类清晰(图2-B)，表明最适亚群数为4，217个自由授粉子代可划分为4个亚群。

Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ： 217个子代217 progenies; Ⅵ: 26个品种26 cultivars.

图2 ‘蓝美1号’217个自由授粉子代的分组分析(A)和K=4时的群体遗传结构(B)

基于上述结果，绘制各子代归入4个亚群的概率(Qi)图，结果(图3)显示：每个子代有4个Qi值，以最大值为分类依据，可得出各亚群中包含子代的编号及数量。亚群Ⅰ包括编号21、113、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、160、165、166、175、177、182、183和211共26个子代。亚群Ⅱ包括编号1、7、8、11、12、13、14、17、18、25、30、31、32、35、39、48、49、51、52、56、59、65、72、80、81、82、85、86、89、91、100、103、106、110、111、120、124、125、127、129、132、134、137、143、153、156、164、171、173、174、176、178、180、188、189、190、199、200、201、202、204、205和216共63个子代。亚群Ⅲ包括编号2、3、9、10、15、16、26、27、29、34、37、41、50、53、60、61、62、64、67、69、71、73、75、83、92、93、94、97、99、105、107、109、114、115、116、118、119、128、133、155、162、170、172、186、193、194、196、207、208、209、210、212、213、214和217共55个子代。亚群Ⅳ包括编号4、5、6、19、20、22、23、24、28、33、36、38、40、42、43、44、45、46、47、54、55、57、58、63、66、68、70、74、76、77、78、79、84、87、88、90、95、96、98、101、102、104、108、112、117、121、123、126、131、136、138、144、147、157、158、161、163、167、168、169、179、181、184、185、187、191、192、195、197、198、203、206和215共73个子代。

比较各子代归入所属亚群的概率(表2)发现，‘蓝美1号’217个自由授粉子代中，192个自由授粉子代的Qi值大于0.6，占总数的88.5%。亚群Ⅰ中26个自由授粉子代Qi值均在0.6以上；亚群Ⅱ中有11个自由授粉子代(编号1、32、39、49、51、129、143、164、176、188和200)Qi值在0.6以下，占亚群Ⅱ子代数的17.5%；亚群Ⅲ中有3个自由授粉子代(编号15、50和212)Qi值在0.6以下，占亚群Ⅲ子代数的5.4%；亚群Ⅳ中有11个自由授粉子代(编号4、23、40、77、87、90、98、123、138、168和169)Qi值在0.6以下，占亚群Ⅳ子代数的15.1%。表明亚群Ⅰ子代遗传来源单一，遗传背景不复杂，而亚群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中虽具有混合遗传来源的子代，但具有混合遗传来源的子代占比不高，亚群内子代相似程度高。

： 亚群Ⅰ Subgroup Ⅰ; ： 亚群Ⅱ Subgroup Ⅱ; ： 亚群Ⅲ Subgroup Ⅲ; ： 亚群Ⅳ Subgroup Ⅳ.

表2 ‘蓝美1号’217个自由授粉子代归入所属亚群的概率(Qi)

2.4 2种分类方法的比较

比较UPGMA聚类分析和STRUCTURE分析的划分结果发现，2种划分结果有相似之处，如编号21、122、130、135、139、140、141、142、145、146、148、149、150、151、152、154、159、165、166、175、177、182、183和211在STRUCTURE分析中划分到亚群Ⅰ，在UPGMA聚类分析中聚为类群Ⅳ；STRUCTURE分析中划分到亚群Ⅲ中的子代在UPGMA聚类分析中大部分被聚为类群Ⅱ。

用POPGENE软件比较2种方法划分的亚群内子代遗传多样性参数，结果见表3。结果显示：STRUCTURE分析中得到的亚群内子代Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s多态性信息指数的均值和标准差均低于UPGMA聚类分析，表明STRUCTURE分析划分亚群内子代遗传多样性水平低、相似程度高，STRUCTURE分析的分群效果优于UPGMA聚类分析。

表 3 2种分类方法中各群体内子代遗传多样性分析

3 讨论和结论

遗传标记在自然群体中的等位基因数越多，该基因座的多态性越高，而当多态性位点大于等于70个时，得到的遗传信息较为可靠[26]。此外，多态性信息含量指数(PIC)越高，SSR分子标记的多态性越丰富，更利于区分供试材料。本研究中共检测出113个多态性位点，引物的PIC均值达0.686 6，可见试验选用的SSR引物能为本研究提供可靠的遗传信息。‘蓝美1号’217个自由授粉子代与26个蓝莓品种在遗传相似系数0.58处分为2大类，表明‘蓝美1号’自由授粉子代和现有蓝莓栽培品种的亲缘关系较远，与现有结论相符，即‘蓝美1号’除通常蓝莓品种含有的遗传基础外，还含有来自野生种的遗传基础。

遗传多样性是物种遗传潜力和适应环境变化能力的重要指标，可从基因水平上反映出群体的变异性，对亲本选配及优良子代初步筛选具有重要的指导意义[27]。本研究中，‘蓝美1号’217个自由授粉子代具有较高水平的遗传多样性，Nei’s遗传多样性指数均值为0.733 4，Shannon’s多态性信息指数均值为1.439 4，而26个蓝莓品种的遗传多样性较低，与崔建民等[9]的研究结果相一致。现有栽培品种遗传多样性较低，遗传基础狭窄，而‘蓝美1号’自由授粉子代具有较高水平的遗传多样性，还含有野生种的遗传基础，是非常好的育种材料，通过后期选育，筛选出优良单株，可以作为国内蓝莓品种改良的优质基因库。

在品种遗传多样性、品种进化和品种标记性状关联分析等研究中，品种资源的群体遗传结构研究是一项最基础的工作[28]。已有研究中划分群体遗传结构的方法主要为STRUCTURE分析和UPGMA聚类分析[29，30]。本研究发现，相较于UPGMA聚类分析，STRUCTURE分析中亚群内子代间遗传相似性更高，分类效果更好，利于解决群体分类对后期关联分析的影响，降低伪关联出现的概率。‘蓝美1号’192个自由授粉子代的Qi值大于0.6，可见供试的绝大多数子代遗传来源单一，且亚群内子代相似程度高，有利于后期优良单株筛选。

综上所述，现有蓝莓栽培品种遗传多样性较低，遗传基础狭窄，供试‘蓝美1号’自由授粉子代与现有蓝莓栽培品种亲缘关系较远，含有野生种的遗传基础，遗传多样性优于现有栽培品种，有利于优良单株的筛选。进一步研究‘蓝美1号’自由授粉子代，从中筛选优良单株，挖掘‘蓝美1号’的抗性基因资源，对实现蓝莓种质创新和遗传基础拓宽具有重要意义。