韦熹苑　 邓琦　卢小玲　舒柯　卓燊　范家文　潘思杏

摘要：为了建立金樱根中没食子酸和儿茶素含量的测定方法，分析广西不同产地金樱根及炮制品中没食子酸和儿茶素含量的变化，该文以没食子酸和儿茶素的含量作为指标成分，采用HPLC法对广西产金樱根生品、炒炙品、酒炙品、盐炙品及醋炙品进行测定，并采用SPSS 23.0软件进行方差分析和聚类分析。结果表明：广西不同产地金樱根及炮制品中没食子酸和儿茶素含量均存在差异，所有样品中儿茶素的含量均比没食子酸高，南部地区（除贵港桂平外）的没食子酸和儿茶素含量整体上比北部地区高，在炮制品中醋炙后没食子酸和儿茶素含量最高。该研究表明HPLC测定方法简单可行，金樱根中没食子酸和儿茶素含量的变化差异主要表现为产地地域及炮制方法的不同，可为今后金樱根资源的合理利用、质量标准制定以及临床用药的研究提供一定科学依据。

关键词： 高效液相色谱， 金樱根， 炮制品， 没食子酸， 儿茶素， 方差分析， 聚类分析

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：10003142（2022）05083312

Difference analysis on contents of gallic acid and catechin in roots of Rosa laevigata and its processed products from different habitats of Guangxi

Abstract：To establish the method for determination of gallic acid and catechin in the roots of Rosa laevigata， and to analyze the difference in the contents of gallic acid and catechin in roots of R. laevigata from different habitats and different processed methods resources from Guangxi. The contents of gallic acid and catechin of R. laevigata were used as evaluation index， the samples were determined by HPLC， and the data were analyzed by the analysis of variance （ANOVA） and discrimination study carried out based on the hierarchical clustering analysis （HCA） with SPSS 23.0 software. The results were as follows：The contents of gallic acid and catechin in roots of R. laevigata from different habitats and processed methods were different， the content of catechin was higer than that of gallic acid among all samples， the contents of gallic acid and catechin in roots of R. laevigata from the southern habitats （except for Guiping， Guigang） were generally higher than those from northern habitats， the contents of gallic acid and catechin were the highest in vinegarprocessed products. The conclusion display that the differences ofgallic acid and catechin contents in the roots of R. laevigata are mainly the differences of producting habitats and processed methods， the HPLC method is simple and feasible， which can provide a scientific basis for the resources development， quality control and clinical application of R. laevigata.

Key words： high performance liquid chromatography （HPLC）， roots of Rosa laevigata， processed product， gallic acid， catechin， analysis of variance （ANOVA）， hierarchical clustering analysis （HCA）

金櫻根（壮文Makgoij）又名金樱、脱骨丹，为蔷薇科植物金樱子

（Rosa laevigata）的根。主要分布于我国华中、华南、华东及西南等地（钟鸣等，2013）。金樱根作为广西道地药材，在民间已被广泛用作药食两用的保健性食材，是广西的大宗特产药物，在广西中药的发展中起着重要的支撑作用。金樱根性味酸涩平，具有清热解毒、凉血活血、祛瘀止痛、固精涩肠等作用，现代药理研究表明金樱根在抗炎、抑菌、抗肿瘤、提高机体免疫功能、抗氧化及抗心率失常等方面具有很好的开发利用价值（龙小琴和戴应和，2017），其所含化学成分没食子酸具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤及保护心血管系统等多种活性（郑雪花等，2017），儿茶素具有抗肿瘤、抗氧化、抗病菌以及保护心脑器官等多种作用（陆昌琪等，2018），由此可见，没食子酸和儿茶素作为金樱根的关键药效组分在临床药理中起主导作用。

金樱根作为广西特色中成药金鸡片、三金片等的君药，但对于金樱根的物质基础研究鲜有报道，且不同产地及不同炮制方法對其有效成分含量影响尚不明确。虽有学者对金樱根不同炮制品总鞣质和总黄酮类成分进行研究，但采用的是紫外分光光度法分析，且研究指标及样本量较少（黄慧等，2011;单于超等，2011），易运红等（2010）比较了金樱子根及茎的总黄酮含量，徐艳春等（2002）对全国22个产地金樱子中三萜酸类成分的含量进行了检测，结果表明，不同产地三萜类有机酸的含量有明显的差别。尚未见金樱根较完整的质量控制标准，缺乏对其进行过程质量控制和药效组分关系的系统研究。本研究以金樱根的关键药效组分没食子酸和儿茶素为指标，采用HPLC法对广西不同产地金樱根及炮制品进行分析，建立HPLC测定两种活性成分的分析方法，同时采用方差分析及聚类分析对指标成分的变化进行对比研究和差异分析，旨在为金樱根广泛深入研究和开发利用提供参考，为金樱根质量标准制定以及临床用药的研究提供一定科学依据。

1材料与方法

1.1 材料和仪器

仪器：Ultimate 3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞公司），KQ500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH4型电热恒温水浴锅（北京科伟永光仪器有限公司），METTLER TOLEDO MS204TS电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（上海精密仪器公司），电磁炉（美的公司）。

试剂：甲醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），磷酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），盐酸（优级纯，昆山金城试剂有限公司），水（UPW50N型超净水器制备纯化水），水（UPW50N型超净水器制备超纯水），甲醇（色谱纯，美国天地试剂公司），没食子酸（中国食品药品检定研究院提供，批号：110831201605），儿茶素（中国食品药品检定研究院提供，批号：110877201203）。

金樱根采自广西9个产地，经贵州省食品药品检验所副主任药师舒柯鉴定为蔷薇科（Rosaceae）植物金樱子（Rosa laevigata）的根，金樱根及不同炮制品（实验室自制）共45个见表1。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的制备精密称取没食子酸对照品2.40 mg，加甲醇溶液定容至100 mL，摇匀，即得0.024 mg·mL1的没食子酸对照品储备液;精密称取儿茶素对照品5.81 mg，加50%乙醇定容至20 mL，即得0.290 mg·mL1的儿茶素对照品储备液。

1.2.2 不同炮制品的制备参照2020版《中国药典》四部项下炮制通则中各炮制品的制备方法，将9批不同产地的金樱根分别称取各1 000 g，每批产地分5份，每份200 g，分别为生品、炒黄、酒炙、盐炙和醋炙。

生品：将9批不同产地金樱根药材净选切制后，40 ℃低温烘干，备用。炒黄品：取上述9批净制后的药材适量（每批200 g），置烧热炒锅内，用文火翻炒至表面颜色加深时，取出，放凉。酒炙品：取上述9批净制后的药材适量（每批200 g），加入定量的黄酒（ 药∶黄酒=100∶20 ） 搅拌均匀，闷透，置烧热炒锅内，用文火炒至表面颜色加深时，取出，放凉。盐炙品：取上述9批净制后的药材适量（每批200 g），加入定量的盐水（药∶食盐=100∶20 ） 搅拌均匀，闷透，置烧热炒锅内，用文火炒至表面颜色加深时，取出，放凉。醋炙品：取上述9批净制后的药材适量（每批200 g），加入定量的米醋（药∶米醋 = 100∶20 ） 搅拌均匀，闷透，置烧热炒锅内，用文火炒至表面颜色加深时，取出，放凉。

1.2.3 样品溶液的制备

1.2.3.1 取1.2.2项下的各样品低温干燥后，粉碎，过三号筛，取各样品粉末0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入4 mol·L1 HCl 50 mL，称定重量，加热回流4 h，取下，放冷，用4 mol·L1 HCl 补足减失的重量，过滤，精密量取续滤液10 mL置于蒸发皿中，蒸干，残渣用甲醇溶解转移到10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，取续滤液，备用于测定没食子酸含量。

1.2.3.2 取1.2.2项下的各样品低温干燥后，粉碎，过三号筛，取本品约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（50∶1）50 mL，密塞，称定重量，分别超声处理（功率250 W，频率40 kHz ） 45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用于测定儿茶素含量。

1.2.4 HPLC色谱条件测定没食子酸色谱条件：色谱柱为 thermosC18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流动相为A（甲醇）-B（0.1 % 磷酸）（5∶95）;检测波长为271 nm;柱温为30 ℃;流速为0.6 mL·min1;进样量为5 μL。测定儿茶素色谱条件：色谱柱为watersC18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流动相为A甲醇B 0.2%磷酸（10∶90）;检测波长为279 nm;柱温为 30 ℃;流速为1 mL·min 1;进样量为10 μL。

2结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系、检出限及定量限分别精密吸取“1.2.1 ”项下的没食子酸和儿茶素对照品储备液1、3、5、10、15 μL，进样测定，记录色谱峰面积，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得各成分的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限，结果见表 2。

2.1.2 精密度试验分别取“1.2.1 ”项下各对照品溶液适量，按“1.2.4 ”项下各对照品的色谱条件各连续进样6次，记录峰面积，没食子酸和儿茶素的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.91%和0.40%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验分别取“1.2.2” 项下S1号样品各6份，以每6份为一组，各组中每份分別按0.1和0.5 g精密称定，再按“1.2.3”项下“1.2.3.1”和“1.2.3.2”的方法制备样品溶液，分别按“1.2.4”项下各色谱条件进样测定，记录色谱图，计算含量，各6份样品的没食子酸和儿茶素含量测定平均值分别为4.902和19.318 mg·mL1，RSD分别为0.80%和1.50%，结果说明两种测定方法重复性均良好。

2.1.4 稳定性试验分别取“1.2.3”项下S1号样品溶液适量，在室温下放置，并分别于0、2、4、8、12、24 h按“1.2.4”项下各自色谱条件进行测定，结果没食子酸和儿茶素峰面积的RSD分别为1.95%和0.96%（n=6），表明样品溶液在24 h内稳定性均良好。

2.1.5 加样回收试验分别取已知含量的S1号样品适量，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入没食子酸对照品溶液（0.226 6 mg·mL1）1 mL和儿茶素对照品溶液（1.946 2 mg·mL1）1 mL，挥干，按“1.2.3”项下两种样品溶液的方法制备，按“1.2.4”项下的各自色谱条件进行测定，结果表明，没食子酸和儿茶素的测定方法均具有良好的加样回收率。具体结果见表3。

2.2 含量测定结果

取 “1.2.2 ”项下样品，按“1.2.3”项下的两方法进行样品溶液的制备，并在“1.2.4 ”色谱条件进行测定，色谱图见图1，记录峰面积，含量测定结果见表4，从实验结果可见，儿茶素含量明显高于没食子酸含量，在同一样品中儿茶素含量是没食子酸的二至九倍，此结果可作为广西金樱根药材的一项重要特征。

2.3 不同产地金樱根聚类分析

用以上9个不同产地金樱根生品中儿茶素和没食子酸的含量作为变量，采用SPSS 23.0软件进行聚类统计分析，结果见图2。 当5<λ≤10时，S1、S6、S11、S16、S21及S26聚为第一类，S36和S41聚为第二类，S31聚为第三类。当10 <λ< 25时，所有样品被分为两类：S1、S6、S11、S16、S21、S26、S36及S41聚为一类;S31单独为一类。从聚类分析结果可知，不同产地的金樱根儿茶素和没食子酸含量具有较明显的地理分布倾向，大致来源于广西北部地区的宜州、柳州、桂林及贺州聚为一类（S1、S6、S11、S16、S21及S26），来源于广西南部地区的贵港平南和钦州平吉聚为一类（S36和S41），来源于广西南部地区贵港桂平单独聚为一类（S31）。广西南部地区的成分与北部地区存在一定的差别，且南部地区的贵港桂平与其他产区的成分差异较大，可能是由于生长环境或药材品种等多方因素影响所致。

聚类分析可将所有样品大致分为三类，聚类后不同类群的没食子酸和儿茶素平均含量比较见表5， 各类群的没食子酸和儿茶素含量均存在显著性差异（P<0.05）。广西南部地区（除贵港桂平外）的没食子酸和儿茶素含量整体上比北部地区高，第三类贵港桂平无论是没食子酸还是儿茶素均比其他类产区低，具体原因有待进一步研究分析。

2.4 不同产地金樱根及不同炮制品中没食子酸和儿茶素含量的方差分析

以没食子酸和儿茶素的含量作为因变量，采用SPSS 23.0软件进行多元方差分析，结果见表6。不同产地的没食子酸和儿茶素含量均具有极显著

性差异（ P<0.01 ），说明金樱根中没食子酸和儿茶素含量均受不同地域环境因素的影响， 与聚类分析的结果相一致，都反映出金樱根药材不同产地间的差异性。在不同炮制方法上，没食子酸含量具有极显著性差异（P<0.01），儿茶素含量具有显著性差异（P<0.05 ），说明炮制方法对没食子酸和儿茶素的含量均有不同程度的影响。

不同产地金樱根及炮制品中没食子酸和儿茶素含量分布见图3和图4，不同产地的金樱根经过炮制后，没食子酸含量和儿茶素的含量均有一定程度的变化，没食子酸含量在四个产区（宜州怀远、桂林灌阳、贵港桂平及钦州平吉），儿茶素含量在六个产区（宜州洛东、桂林灌阳、桂林全州、贵港桂平、贵港平南及钦州平吉）的个别炮制方法中略有下降，但在所有产区中醋炙后没食子酸和儿茶素含量均有所升高，分别达到（0.66±0.16） mg·g1和（2.83±0.87） mg·g1。对不同炮制方法下没食子酸和儿茶素的含量进行进一步的方差分析，结果见表7，醋炙品与其他炮制品都存在显著性差异（P<0.05）和极显著性差异（P<0.01），因此，表明醋炙方法最适合金樱根炮制加工，能有效提高没食子酸和儿茶素的含量。

3讨论与结论

3.1 色谱条件及提取方法的考察

在进行色谱条件摸索实验中，依次选用甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸等系统进行检测，200～400 nm波长下进行全波长扫描，色谱柱分别用watersC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、迪马色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、依利特C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、thermosC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）进行考察，柱温和流速分别用20、30、40 ℃ 和0.8、1.0、1.2 mL·min1 进行筛选，由于考虑到没食子酸和儿茶素都是含有酚羟基的酸性化合物，极性都比较大，而且金樱根的成分多以极性较大的成分为主（李石平，2013），因此，为使得分离度好，且峰型效果显著，在流动相中加入不同种类和比例的酸性试剂进行筛选（耿丽等，2020），最终测定没食子酸流动相为甲醇-0.1%磷酸（5∶95），色谱柱为 thermosC18（250 mm ×

4.6 mm，5 μm），检测波长为271 nm，流速为0.6 mL·min1，柱温为30 ℃;测定儿茶素流动相为甲醇-0.2%磷酸（10∶90），色谱柱为watersC18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm）;检测波长为279 nm;柱温为30 ℃，流速为1 mL·min1，在这些条件下色谱峰的分离好、基线平稳、杂质峰的干扰少。

前期在对金樱根药材提取工艺的考察中，分别以没食子酸和儿茶素含量为测定指标，将提取溶剂（不同浓度甲醇、不同浓度乙醇、不同浓度盐酸、不同比例的甲醇-盐酸），提取方式（加热回流、超声提取），提取时间（30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h）及称样量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等作为考察因素，最终以所测成分（没食子酸和儿茶素）含量最高作为优选条件。因此，分别选用0.1 g称样量，4 mol·L1 盐酸溶液加热回流4 h作为没食子酸测定的提取方法;0.5 g称样量，甲醇-盐酸（50∶1）溶液超声处理提取45 min作为儿茶素测定的提取方法。

在金樱根药材含量测定中多数集中在采用UV法进行（单于超和田素英，2011;黄慧等，2011;苏亦用等， 2012; 朱萱萱等，2021），本研究建立了

HPLC测定金樱根中没食子酸和儿茶素的测定方法，该方法操作简单，能使没食子酸和儿茶素与其他干扰峰达到基线分离，且灵敏、可靠、重复性好，因此能更准确地对金樱根进行定性和定量分析。

3.2 基于没食子酸和儿茶素含量测定的金樱根质量评价及其炮制方法的优选

目前，对金樱根中含量测定的报道多以测定某一类化学成分含量为主，如黄慧等（2011）对湖南产金樱根不同炮制品中的总鞣质含量进行测定，结果显示炮制后总鞣质含量降低，单于超等（2011）分别对不同产地金樱子根、阳枝总鞣质的含量测定和金樱根不同炮制品中总黄酮含量进行测定，结果认为广西产金樱根中总鞣质含量最高和不同炮制方法对金樱根中总黄酮含量的影响较大，以上研究只对某一产地炮制品或几个产地的某类成分含量进行研究，样本量及测定指标都较单一。没食子酸和儿茶素是金樱根发挥药效作用的重要基础物质，它们均具有酚羟基结构，有一定的酸性，同时儿茶素具有苦涩味（Scharbert & Hofmann， 2005; 张英娜等，2017）， 可见金樱根性

味酸来源于没食子酸和儿茶素，涩味主要来源于儿茶素，因此，测定没食子酸和儿茶素含量具有重要的意义。本研究选取广西9个不同产地金樱根及炮制品作为研究对象， 并以没食子酸和儿茶素

作为测定指标，样品量包括了广西大部分产区，因此，测定结果能更好地评价广西金樱根药材的质量及优选适合的炮制加工方法。

没食子酸和儿茶素为植物二次代谢产物的多酚类成分，它們的合成与积累受气候变化、地理环境等因素的影响（董娟娥和梁宗锁，2004;钱家萍等，2020），本研究发现不同产地的金樱根中儿茶素和没食子酸含量具有较明显的地理分布倾向，且广西南部地区（除贵港桂平外）没食子酸和儿茶素的含量整体上比北部地区高，金樱根植物喜温暖湿润的气候和阳光充足的环境（李小明，2010），广西南部地区属于南亚热带气候，全年气候较暖热，雨量及光照充沛（况雪源等，2007），且研究发现光照强度的升高能增加植物体内多酚物质的含量（程春龙等，2008），因此，广西南方气候条件可能是影响金樱根中没食子酸和儿茶素含量升高的因素之一，然而南部地区的贵港桂平与其他产区的成分差异较大，可能是由于生长环境或药材品种等多方因素影响所致。由于本次研究数据指标有限，对于地理环境等其他因素是否影响金樱根中没食子酸和儿茶素的含量需进一步研究，后期可通过再扩大样本量，考察多项影响指标（如土壤成分，海拔高低等）来进行深入分析。

本研究对不同产地金樱根及炮制品中没食子酸和儿茶素进行方差分析，发现经炮制后没食子酸和儿茶素的含量均有一定程度的变化，推测是在炮制过程中，受加热、辅料等因素影响所致。此外，在同一炮制方法中出现产地间的没食子酸和儿茶素含量升降不一致的现象，可能是个别产地金樱根中含有某些成分而产生化学变化或由于在实验中操作不当等因素所致。本研究中，醋炙后没食子酸和儿茶素含量均升高，这与笔者前期研究金樱根炮制品中金属含量醋炙方法最优相一致（韦熹苑等，2021）。分析醋炙后没食子酸含量升高的原因可能是由于在加热和酸性条件下，金樱根中鞣质类成分或含有没食子酰基的苷类成分， 在加热炮制条件下分解， 从而导致没食子酸含量增加（王云等，2010）。醋炙后儿茶素含量升高可能是由于在中性和碱性条件下儿茶素不稳定，而在一定pH的酸性条件下可稳定存在（张盼等，2020），因此使得能最大限度地保存儿茶素的成分（吴梦琦等，2019），另外也有可能是糖苷类成分转化成儿茶素，并在酸性条件下稳定存在。综上所述，对于金樱根各炮制品的炮制机制仍有待进一步研究。

3.3 结论

本研究采用HPLC法建立金樱根中没食子酸和儿茶素含量的测定方法，为研究广西金樱根药材资源的合理利用及质量标准提供一定的科学依据，同时通过探讨金樱根炮制前后没食子酸和儿茶素含量的变化规律，揭示金樱根炮制的科学性，为今后研究金樱根炮制品中化学成分的变化机制与药理活性的关系打下一定的实验基础。

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（责任编辑周翠鸣）

收稿日期：2021-02-19

基金项目：广西科技开发项目（桂科AD19110088）;广西高校中青年教师基础能力提升项目（2018KY0332）

第一作者： 韦熹苑（1985-），硕士，工程师，主要从事中药成分分析工作，（Email）249265851@qq.com。

通信作者：舒柯，硕士，副主任药师，研究方向民族药成分分析与研究，（Email）50618622@qq.com。