刘春旭，孙红霞，胡 波，安学俊，纪影实，姜恩平

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011； 3.吉林大学基础医学院，吉林 长春 130021；4.广东医科大学基础医学院，广东 东莞 523808)

心肌纤维化(MF)是以心肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质中胶原过度沉积为特征的心脏间质重构，许多刺激因子如醛固酮转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)、炎症因子白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)等因素都参与了诱导MF的发生[1].MF可损害心脏收缩舒张功能，使心室射血功能下降，MF是众多心脏疾病共同的最终的病理学改变，可导致心律失常、心衰乃至猝死等发生[2]，因此，探索MF发病机制及治疗尤为重要.目前临床上对MF治疗方式主要是通过药物干预，常见的有普利类、沙坦类、螺内酯等，但疗效均不尽人意.随着对五味子功效成分分离和其对心脏保护作用研究的深入，本科研团队前期研究[3]发现五味子多糖对MF有保护作用.SchB是五味子有效单体成分之一，通过研究[4]证实SchB对CFb增殖有抑制作用，但作用机制不详.因此，本研究通过观察SchB对CFb增殖的抑制作用及对关键细胞周期蛋白的影响，以判定其抑制CFb作用机制，为其深入开发研究寻找药理学依据.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂仪器

五味子乙素(成都埃法生物科技有限公司，批号：61281-37-6)；胰蛋白酶(杭州浦泰生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；AngⅡ(Sigma公司，美国)；cyclinA和E、 P21cip1和P27kip1、MTT(Sigma公司，美国)；IMDM培养基 (Hyclone公司，美国)；培养箱(松下公司，日本)；酶标仪(TECAN 公司，瑞士)；CX33倒置显微镜(OlymPus公司，日本)；Attune NxT流式细胞仪(Invitrogen公司，美国)；超净工作台(山东博科生物产业有限公司).

1.2 细胞培养

取出生1～3 d的SD大鼠的心室，用0.25%胰酶消化后收集所有细胞，置于含有10%胎牛血清的细胞培养液中，在CO2浓度5%、氧气浓度95%、室温37 ℃的湿度饱和条件下继续培养90 min.根据不同细胞贴壁时间差别将CFb分离出来后，用含有10%胎牛血清的IMDM培养基继续培养.最后通过显微镜、IC法证实FN染色(+)和SMA-α染色(-)鉴定为所需的CFb，纯度达到97%近乎融合时按1∶3进行传代，正式实验采用3～4代细胞.

1.3 实验分组

将SD大鼠分为5组.空白对照组：不含药物的IMDM培养液；AngⅡ模型组(终浓度为10-1μmol/L)；SchB低剂量组即SchB-L组(AngⅡ+1 μmol/L SchB)、SchB中剂量组即SchB-M(AngⅡ+10 μmol/L SchB)、SchB高剂量组即SchB-H(AngⅡ+ 30 μmol/L SchB).

1.4 MTT检测各组吸光度值和PI值

将之前分组的CFb接种96孔板上，每组设置6复孔，各剂量SchB 孵育24 h.在实验终止前4 h加入5% MTT，待肉眼看到蓝紫色沉淀后，加入150 μL DMSO降解沉淀，调节波长为490 nm，在酶标仪上测定吸光度值(A)，用含有IMDM无CFb空白孔调零.各药物组A值与AngⅡ相比较，用A值差值百分率代表CFb增殖抑制率(PI).

1.5 FCM检测各组的细胞周期、细胞增殖百分率和增殖指数

收集各处理组作用24 h后CFb，经70%乙醇处置过夜后，离心重悬于PBS中，收集细胞悬液加入RNA酶，37 ℃水浴30 min，加入PI 1 mg/mL，避光30 min冰浴.在FCM检测前进行过滤，通过PI标记的DNA含量确定CFb所处的时期，计算出各时段CFb分布的细胞周期百分率.以增殖指数(PI)表示增殖活性，计算公式：PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%.应用Cell Quest软件获取数据，并对数据进行细胞周期分析.

1.6 ELISA法检测CFb中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平

各实验组作用24 h后，提取各组细胞上清液，每组设6组重复孔，严格按照ELISA说明书进行操作.

1.7 免疫印迹法检测细胞中细胞周期蛋白cyclinA和cyclinE及细胞周期抑制蛋白P21cip1及P27kip1表达

各处理因素分别作用24 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法计算样品蛋白浓度.取100 μg样品进行12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100 V 20 mA电转移2 h，将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA封闭2 h，加1∶1 000稀释的小鼠抗大鼠cyclinA，cyclinE、P21cip1、P27kip1单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，次日用1∶200稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温孵育2 h，洗膜，化学发光法(ECL)曝光显影.采用quantity one软件分析结果，用目标蛋白与β-actin比值表示蛋白含量.实验重复3次.

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 MTT法检测SchB 对CFb增殖抑制作用

与模型组比较，对照组CFb增殖抑制率为61.5%，与模型组比较，AngⅡ+SchB低、中、高剂量组CFb增殖抑制率分别为34.82%、23.74%、47.77%(P<0.01)，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01).见图1.

图1 光学显微镜下观察各组CFb细胞形态学变化 (×100)

2.2 流式细胞术检测SchB对CFb细胞周期百分率和PI的影响

与对照组比较，AngⅡ组S期的细胞百分率明显升高，G0/G1期细胞百分率明显下降(P<0.01)，细胞增殖指数(PI)明显提高(P<0.01)；SchB作用后，与AngⅡ组相比较，CFb 中S期细胞百分率明显降低，而G0/G1期细胞百分率显著升高，PI明显下降(P<0.05或P<0.01).见图2.

2.3 ELISA法检测SchB对CFb中CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达水平的影响

与对照组比较，模型组collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，SchB-L、SchB-M、SchB-H 组collagen I、collagen Ⅲ蛋白表达水平明显降低(P<0.01).见表1.

2.4 Western blot法检测SchB对细胞中细胞周期蛋白cyclinA和cyclinE蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组cyclinA和cyclinE蛋白表达水平明显增加(P<0.01).与模型组比较，SchB-L、SchB M、SchB H组中cyclinA和cyclinE蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01).见图3.

2.5 Western blotting法检测SchB对CFb中细胞周期抑制蛋白P21cip1和P27kip1蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组P21cip1和P27kip1蛋白表达水平明显减少(P<0.05).与模型组比较，SchB低、中、高剂量组CFb中P21cip1和P27kip1蛋白表达水平明显增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001).见图4.

1.对照组；2.模型组；3～5.SchB低、中、高剂量组. **.与对照组比较P<0.01；与模型组比较△.P<0.05，△△.P<0.01.图3 免疫印迹法检测SchB对细胞周期蛋白cyclinA和cyclinE蛋白表达的影响Fig.3 Effect of SchB on protein expression of cyclinA and cyclinE by Western blotting methods

1.对照组；2.模型组；3～5.SchB低、中、高剂量组. 与对照组比较*.P<0.05，**.P<0.01；与模型组比较△.P<0.05，△△.P<0.01，△△△.P<0.001.图4 免疫印迹法检测SchB对细胞中细胞周期抑制蛋白P21cip1和P27kip1蛋白表达的影响Fig.4 Effect of SchB on cyclin inhibiting protein P21cip1and P27kip1by Western blot assay

3 讨 论

心肌纤维化(MF)是以CFb过度增殖和胶原蛋白分泌增加为主要变化的疾病，并参与心室重塑.MF的发生以CFb增殖为主要特征，同时伴有ECM过度分泌，引发一系列心脏功能改变如心室僵硬、心脏功能受损等，探究其增殖过程并选用药物及时干预是治疗的重点.

细胞周期是细胞增殖的基本单位，细胞周期在正负调控因素共同作用下协调进行，正调控因素有细胞周期蛋白cyclin、细胞周期激酶(cycle dependent kinase，CDK).正性周期蛋白有cyclinA、B、D及cyclinE等，cyclinE参与G1期到S期转化，cyclinA参与S期到G2期转化，正调控因子cyclinA、cyclinE通过激活CDK2调控染色体复制[5].负性周期蛋白，如细胞周期素依赖激酶抑制因子CDKI包括P21cip1、P27kip1等，是控制G1/S转换的CDK抑制剂，抑制大多数CDK-cyclin的磷酸化激酶活性，正调控因素的增强和负调控因素作用的减弱是细胞增殖的关键[8].相较P21cip1而言，P27kip1蛋白是近年来备受关注的细胞周期负性调节因子，对其研究较多，其能够阻滞细胞于G0/G1期从而抑制细胞增殖，其中G1/S期调控点是决定细胞增殖的关键.

正常情况下，作为负性调控蛋白，P21cip1和P27kip1可通过抑制cyclinE-CDK2复合物的活性，抑制G1向S期的转变，即抑制细胞增殖.研究[6]发现：P21cip1和P27kip1蛋白作为负性调节因子影响细胞周期的变化，在左室肥厚中起重要作用.研究[7]显示：P27kip1蛋白表达上调在AngⅡ刺激导致的心血管和肾细胞肥大中发挥重要作用，引发如动脉粥样硬化(AS)和心血管重塑等疾病的发生.心肌细胞中CFb在异常激活状态下能够以自分泌或旁分泌途径分泌强效促进细胞增殖和分裂的细胞因子(MC)，如果MC持续存在，细胞周期中的激酶在G1期可不断累积，所有的P21cip1、P27kip1蛋白分子进入到细胞周期中后均与CDK复合物连接在一起，使其本身抑制作用被限制，随后cycleE-CDK2被激活，未结合的P21cip1、27kip1被磷酸化，泛素连接酶可识别磷酸化后的P21cip1、P27kip1，并对其进行降解，细胞周期得以向前发展通过限制点.如果MC被清除，则cycle D很快被降解，P21cip1、P27kip1被从结合状态中释放出来，而抑制cycle E-CDK2，从而使细胞周期停滞在G1期[8].因此,有丝分裂原可直接抑制P21cip1和P27kip1蛋白分子，而抗有丝分裂原能促进二者合成.P21cip1和P27kip1又可通过抑制cycleE-激酶活性，抑制细胞由G1期向S期转化，抑制细胞增殖[9].研究[10-11]还发现：给动物注射一定量的AngⅡ能降低P21cip1和P27kip1的表达并促进CFb增殖，提示P21cip1和P27kip1可能是AngⅡ促增殖作用的负性调控因子.AngⅡ通过AT1受体结合，激活Ras-MAPKs和PI3K通路信号分子，进而抑制P21cip1和P27kip1蛋白的合成，使其迅速降解，蛋白水平下降，解除正向细胞周期调控的cyclinE-CDK2复合物的抑制作用，使Rb基因磷酸化，释放E2F等转录因子进入核内，促进与基因表达有关的与DNA转录、复制基因相关的启动子区，通过G1/S限制点细胞能够顺利进入S期，启动其分裂增殖过程[12-14].

本研究结果显示：与模型组比较，SchB明显抑制AngⅡ促CFb增殖和Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白分泌，降低cyclinA、cyclinE蛋白表达水平，提高P21cip1和P27kip1蛋白表达水平，差异显著(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；流式细胞术结果显示：AngⅡ可诱导CFb增殖，SchB干预能使CFb增殖受阻.与模型组比较，SchB组CFb细胞周期G0/G1期细胞百分率明显提高，S期细胞百分率明显降低(P<0.05或P<0.01)，表明SchB干预作用可能通过阻断CFb增殖的细胞周期、抑制AngⅡ诱导的CFb增殖作用，从而使胶原蛋白表达减少.本研究结果显示：与细胞增殖有关的细胞周期蛋白受到不同程度的调节后，可使CFb增殖受阻；与模型组比较，SchB 3个剂量组上述各指标均有显著性差异(P<0.05).

综上所述，AngⅡ通过作用于CFb AT1受体，激活细胞内外相关通路促进CFb增殖和胶原蛋白表达诱导心肌纤维化的发生，SchB通过调控细胞增殖过程中重要细胞周期蛋白cyclinA、E、P21cip1和P27kip1等，降低CFb增殖和胶原蛋白的合成和分泌，拮抗AngⅡ的诱导作用，让细胞周期停滞于静止期，使细胞增殖受阻，从而抑制CFb的增殖过程.