方楷漪，刘宇轩，黄莉莉，杨馥旭，胡楠楠，郭 冲，穆业腾，谢 宇，夏 薇，关新刚

(北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

近年来，基于蛋白质的药物递送载体因其本身材料特性及可通过基因工程改造等优势引起了广泛关注[1].在众多蛋白递送载体中，蛋白质自组装得到的纳米笼具有结构高度稳定、尺寸均一、体内代谢时间长等特性成为药物递送的理想候选载体之一.此外，蛋白质纳米笼内腔可以担载药物或成像基团，笼外表面可通过基因工程进行功能修饰，自组装成中空笼形结构的蛋白质，如小热休克蛋白(heat shock protein)[2-3]、铁蛋白(ferritin)[4-7]、病毒衣壳[8]等，在肿瘤诊断和治疗领域取得了重要进展.

热聚体(Thermosome，THS)是一类从嗜热古细菌中分离得到的一大类分子伴侣蛋白，因其在外界环境突然热刺激情况下大量表达而得名[9].嗜酸热浆菌(Thermoplasmaacidophilum)中的热聚体蛋白是一种2型分子伴侣蛋白，由两个堆叠的八元环组成，形成笼状结构[10-12].每个环形成一个半球，由交替的α和β亚基组成并包裹一个直径约为16 nm的中心腔和130 nm3的空腔体积[13].2009年，Nico Bruns团队设计制备了用于siRNA递送的THS蛋白纳米载体，将THS纳米笼修饰细胞穿膜肽后能够将siRNA高效递送到肿瘤细胞中[14].本研究通过表达并纯化THS蛋白，制备了THS蛋白纳米笼，探讨其基本特征及细胞相容性，可为开发基于热聚体的高效、安全递送系统提供数据支撑.

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和主要试剂

pET-Therm α/β质粒(英国斯特拉斯克莱德大学Nico Bruns教授惠赠)；大肠杆菌BL21菌株、CT26细胞(北华大学肿瘤靶向治疗重点实验室保存)；酵母提取物、胰蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、Tris-HCl、蛋白质标准品(上海碧云天生物技术有限公司)；考马斯亮蓝R-250(生工生物工程(上海)有限公司).

1.2 热聚体蛋白的原核表达

将pET-Therm α/β质粒转入E.coli大肠杆菌BL21感受态细胞，菌液均匀涂布于LB(Luria Bertani)固体培养基上，37 ℃温箱培养过夜.挑取单克隆菌落接种到LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜；第2天将过夜培养菌液按照1∶500比例加入TB培养基中，30 ℃继续振荡培养18 h.离心收集菌体，TEN缓冲液重悬后通过超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)裂解菌体，离心收集超声后的上清，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况.

1.3 热聚体蛋白的纯化

将超声后的上清pH用NaOH调节至7.5，在核酸蛋白层析系统(HD-3007)中预热30 min，吸光度调到280 nm.将BioGel-P150凝胶与双蒸水按照V(胶)∶V(水)=1∶10比例混合，90 ℃水浴2 h，使凝胶升温溶胀，除去上清液中的凝胶碎块，直至上清液澄清.装上色谱柱，加入约1/3柱床体积的PBS，沿柱子一侧将凝胶缓慢连续注入柱内.凝胶沉积后，打开柱子下口，控制流速为1 mL/min，加入柱床体积5%THS蛋白溶液进行纯化与收集，并将收集到的蛋白溶液行SDS-PAGE电泳分析.

1.4 热聚体蛋白组装体的表征

用纳米粒度分析仪(Nanotrac Wave Ⅱ 型，Microtrac公司，美国)测定纯化后THS的粒径，在测量前将蛋白样品振荡混匀，用0.45 μm PES(聚醚砜)针头过滤器过滤，再取200 μL样品加入分析仪测量孔测量，用场发射透射电镜(JEM-1011型，JEOL公司，日本)检测纳米粒形貌(加速电压为100 kV).

1.5 细胞相容性分析

应用MTT法检测THS蛋白对CT26细胞增殖能力的影响.将CT26以5 000个/孔细胞铺于96孔板上，37 ℃培养24 h，然后分别加入终浓度为12.5、25、37.5、50、100 μg/mL的THS蛋白.每个浓度设置5个复孔，同时对照孔内加入DMEM培养基，培养48 h后，每孔加入20 μL MTT(噻唑蓝5 mg/mL)，37 ℃孵育，4 h后弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，溶解后用酶标仪(Spark 20M型，TECAN公司，瑞士)检测其在490 nm处的吸光度值.

1.6 细胞摄取

利用马来酰亚胺功能化的荧光素5-FAM与THS蛋白中的半胱氨酸巯基反应制备5-FAM标记的THS蛋白纳米颗粒.将5-FAM-Maleimide与THS蛋白溶液混合(25∶1)，4 ℃避光反应过夜，透析除去未反应蛋白，得到5-FAM-THS；将对数生长期的CT26细胞接种于含小圆盖玻片的24孔板中，37 ℃培养24 h，把标记好的5-FAM-THS蛋白与CT26细胞混匀，37 ℃共孵育约6 h，弃去孔中培养液，用PBS洗涤细胞2次，在室温下用4%的多聚甲醛固定20 min，应用PBS缓冲液清洗2次，然后DAPI室温染色10 min，再应用PBS缓冲液清洗3次；将染色的盖玻片倒置于载玻片上，封片后于激光共聚焦荧光显微镜(Zeiss LSM710)下成像.

2 结 果

2.1 THS蛋白的原核表达及纯化结果

将pET-Therm α/β质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，TB培养基培养18 h，超声破碎后离心收集裂解液上清和沉淀.SDS-PAGE电泳结果分析显示：上清液中，在分子量60 kDa左右出现明显的两条蛋白条带，上下两条带分别对应分子伴侣蛋白THS组装体的α和β亚基，与预计分子量相符.由图1可见，THS主要以可溶性蛋白形式分布于菌体裂解液上清液中，为后续利用核酸蛋白层析系统纯化提供有利条件.

M.Marker；1、2.细菌裂解液上清.图1 THS蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of THS protein

利用BioGel P150通过凝胶过滤层析纯化THS蛋白，纯化结果见图2.在预计分子量大小附近出现比较明显的蛋白条带，尽管在目的条带下方有少量杂蛋白条带，但目的蛋白仍然显示出较高的蛋白纯度.

M.Marker；1、2.THS蛋白.图2 THS蛋白的纯化结果Fig.2 Purification results of THS protein

2.2 THS蛋白纳米颗粒的粒径和形貌表征

有研究[13]显示：THS蛋白组装体是由8个α和β亚基交替自组装成的空心纳米笼结构，动态光散射结果显示Thermosome蛋白的平均粒径为20.2 nm.见图3.透射电镜(TEM)结果显示蛋白笼纳米颗粒在电镜下呈现为中空球形结构.见图4.

图3 THS蛋白纳米颗粒的粒径分析Fig.3 Size distribution of THS protein nanoparticle

图4 THS蛋白纳米颗粒的形貌分析Fig.4 Morphology analysis of THS protein nanoparticle

2.3 THS蛋白纳米颗粒的细胞相容性分析

利用MTT法检测不同浓度的THS蛋白对CT26细胞增殖的影响.结果见图5.当THS蛋白浓度为100 μg/mL时，细胞生存率仍接近100%，说明蛋白具有良好的细胞相容性.

图5 THS蛋白纳米颗粒的细胞相容性分析Fig.5 Cell viability analysis of THS protein nanoparticle

2.4 THS蛋白纳米颗粒的细胞摄取

为研究THS蛋白纳米颗粒能否被肿瘤细胞摄取发挥药物递送载体的作用，我们制备了绿色荧光染料5-FAM标记的THS蛋白.荧光标记的纳米颗粒与结肠癌细胞CT26孵育后的结果见图6，图中可见绿色荧光分布在细胞核周围的胞质中，提示蛋白纳米粒成功进入细胞内，为发挥药物递送功能奠定基础.

图6 THS蛋白纳米颗粒的细胞摄取(比例尺为20μm)Fig.6 Cellular uptake of THS protein nanoparticle(scale bar：20μm)

3 结 论

近年来，蛋白质纳米笼通过递送小分子、大分子及纳米粒在肿瘤治疗、疫苗研发及疾病诊断等领域得到了广泛应用，通过在蛋白纳米笼外表面引入小分子(如叶酸)、多肽(如RGD、细胞穿膜肽)、抗体、核酸(适配体)、聚合物等配体和功能分子设计开发的多功能药物递送平台已被相继报道[15-18].本研究显示：热聚体蛋白笼作为siRNA递送载体用于肿瘤细胞基因沉默也显示出较高的递送效率和良好的细胞相容性.与其他蛋白质纳米笼不同，热聚体蛋白笼是由α和β亚基八聚体自组装形成的由上下两个空腔组成的纳米笼，如何精确设计上下空腔的货物装载以便发挥更复杂的递送功能是未来要重点关注的问题.

综上所述，本研究成功表达并纯化了THS蛋白，得到THS组装体纳米颗粒，纳米颗粒在CT26细胞上显示出良好的细胞相容性，可成功被结肠癌细胞CT26内吞，为进一步研究热聚体蛋白纳米笼的药物递送功能奠定了基础.蛋白质纳米笼的孔隙有利于腔内药物的装载及释放，作为新型药物递送载体具有独特优势.THS蛋白纳米笼的孔隙直径为8 nm，因此，大分子可以不受阻碍地进出THS腔而不损坏其结构[15-17].与其他纳米笼材料相比，THS蛋白还具有高稳定性、无毒性、循环半衰期长、生物相容性好、表面改性容易等优点，这些特性提示THS纳米载体在药物递送系统中具有广阔的发展空间[16-17].