程辰 李雪平 徐艺 赵红艳 赵海涛连云港市中医院超声科，连云港 00；连云港市第一人民医院超声科，连云港000；连云港市第一人民医院药学部，连云港 000；连云港市中医院普外科，连云港 00

通信作者：赵红艳，Email：643627734@qq.com

作为当下全世界女性群体较为常见的恶性肿瘤疾病，乳腺癌在所有的女性恶性肿瘤疾病方面位列首位。虽然该疾病的发病率常年居高不下，但因相关治疗技术趋于完善，病患的5 年生存情况表现较好。相关数据表明，欧洲一地2006 至2012 年期间，该病患的5 年生存情况从二十年前的83%，攀升至88%，相对生存率更是从91%增长到了96%。基于医学技术的进步，分子生物标志物越来越多［1］，靶向明确的新辅助化疗及内分泌治疗的广泛开展，使乳腺癌的生存率及预后有了大幅度改善，也使得该疾病的治疗方案趋近于慢性疾病管理［2］。因此，构建起围绕个体特性以及分子生物标志的预后评价机制显得尤为必要。除人表皮生长因子受体2（HER-2）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）外，细胞增殖相关抗原（Ki-67）、表皮生长因子受体（EGFR）和上皮钙黏附蛋白（E-cad）目前已经成为临床病理学中用以评估肿瘤生长活跃程度的常用指标，并且已经在结直肠癌、宫颈癌、神经内分泌癌及胃肠道间质瘤等肿瘤中得到广泛应用。关于Ki-67、EGFR、E-cad 在乳腺癌中的表达及其对预后的影响，目前只有少数研究，并且部分显示出相互矛盾的结果。

为此，我们进一步探讨Ki-67、EGFR、E-cad 的表达水平和该疾病的临床病理治疗、预后等联系，探索Ki-67、EGFR、E-cad对于乳腺癌患者生存时间的影响，以期为临床决策提供依据。

资料与方法

1、研究对象

本文回顾性研究2015 年5 月至2021 年12 月连云港市第一人民医院及连云港市中医院经手术切除的乳腺癌标本167 例，随访并整理患者病例资料，时间起点为患者的手术日期或临床活检病理确诊日期，以患者失访、最后1 次随访时间（随访截止时间为2022 年4 月）或死亡为节点，研究终点为死亡。（1）纳入标准：①女性；②手术病理或临床活检确诊为乳腺癌的患者；③给予规范化治疗的乳腺癌患者；④相关病例资料完善。（2）排除标准：①其他组织来源肿瘤；②随访信息不完整者；③新辅助化疗或内分泌治疗不规范者。

2、研究方法

2.1、资料收集 通过连云港市第一人民医院及连云港市中医院病案管理系统，按照标准检索出2015 年1 月至2021 年12 月满足条件的患者住院基本信息和相关原始资料，梳理研究所需要的病例资料，汇总为表格。

2.2、随访 通过电话随访以及现场访谈等方式，以手术开始或组织活检病理确诊日期为随访起点，随访截止日期为2022 年4 月1 日，随访过程中因失访未产生结果事件者定义成截尾。

2.3、评价标准 总生存期（OS）即患者确诊日期为起点至患者死亡或研究结束期间的时间。期间由开始时间至肿瘤及其并发症导致死亡时间或最后1 次随访时间为完全数据。由随访开始日期至截尾日期为截尾数据。

3、病理数据

（1）TNM 分期：参照第八版AJCC 公布的乳腺癌分期分期标准［3］，记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。（2）病理分子分型：根据ER、PR及HER2的表达，将乳腺癌分为以下分子分型：Luminal A 乳腺癌、Luminal B 乳腺癌、HER-2 阳性（HR 阳性）乳腺癌、三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）。（3）ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR、E-cad 的判读标准。ER、PR 判读：肿瘤细胞核染色≥1%的任何强度染色判读为阳性，＜1%肿瘤细胞核染色为阴性。HER-2 判读：按照阳性细胞表达的数量分为4级（-、+、++、+++），-、+判定为阴性，++、+++判定为阳性。Ki-67 判读：Ki-67 阳性定义为细胞核染色为淡黄至棕黄色，随机选择10 个400 倍镜进行计数，计算Ki-67 阳性细胞数占总细胞数的百分比。Ki-67≤14%为低表达，Ki-67＞14%为高表达。EGFR、E-cad 判读：按照阳性细胞表达的数量分为4级（-、+、++、+++）。

4、预后评价标准

Neo-Bioscore 评分系统的具体评分如下：ER 阳性、阴性分别对应0、1分；HER-2阳性、阴性分别对应0、1分；组织学分级：1～2级0分，3级1分；新辅助治疗前临床分期：Ⅰ、ⅡA期均为0 分，ⅡB、ⅢA 期均为1 分，ⅢB、ⅢC 期均为2 分；术后病理分期：0期与Ⅰ期均为0分，ⅡA、ⅡB期、ⅢA期及ⅢB期均为1 分，ⅢC 期为2 分。将Neo-Bioscore 评分分为0、1、2、3、4、5、6、7共8个分级。

5、统计学方法

通过Excel软件对随访患者的资料进行整理汇总，建立数据库。运用SPSS 24.0 软件分析、处理数据。计数资料的组间比较采用卡方检验，检验水准α=0.05，若P＜0.05则认为数据差异有统计学意义；运用Spearman进行关联性研究，评价生物学预后因子与临床病理特征、预后评价体系Neo-bioscore 相关性的研究；对OS、生存分析进行观察，按照Kaplan-Meier 法进行绘制，得到生存曲线。在此基础上，采用Cox 回归模型，排除混杂因素所产生的影响，开展多因素分析。

结 果

1、一般资料

经手术切除的乳腺癌标本167例，患者年龄21～79岁，平均年龄46.4 岁。参照世界卫生组织标准病理学，其中有101 例浸润性导管癌，39 例非特殊浸润性导管癌，5 例粘液癌、7 例原位癌、37 例导管内癌（单发或合并浸润性导管癌）。病理分子分型中，Luminal A 型26 例，Luminal B 型56例，HER-2阳性（HR阳性）57例，三阴型28例。随访中有淋巴结转移72例，术后复发13例，4例出现了肝、肺、骨转移等问题；其中，有131 例接收了新辅助化疗，31 例接收内分泌治疗，5例转外后续治疗。

2、乳腺癌组织中Ki-67、EGFR、E-cad 的表达与患者临床病理特征的关系

Ki-67、EGFR、E-cad的表达水平分别与患者的年龄、肿块的位置、肿瘤长径、淋巴结是否转移、TNM分期之间，差异均无统计学意义（均P＞0.05），但其乳腺癌的病理分子分型与Ki-67、EGFR 表达差异均有统计学意义（χ2=30.463，P＜0.001；χ2=25.652，P＜0.001）。 Ki-67 与EGFR，EGFR 与E-cad 之间的表达水平差异均有统计学意义（χ2=7.167，P=0.007；χ2=18.576，P＜0.001）。

3、Ki-67、EGFR、E-cad 的表达与患者临床病理特征的相关性研究

Ki-67与肿瘤长径有一定正相关性（r=0.159，P=0.041），即肿瘤长径越大，则Ki-67 的表达水平可能越高，但相关系数r＜0.2，说明关系紧密性一般。乳腺癌的分子分型分别与Ki-67、EGFR、E-cad 的表达水平有显著相关性（r=0.414，P＜0.001；r=0.379，P＜0.001；r=-0.170，P=0.028），其中乳腺癌的分子分型与Ki-67、EGFR 有紧密的正相关性，与E-cad有紧密的负相关性。EGFR 与Ki-67 的表达水平有紧密的正相关性（r=0.207，P=0.007），与E-cad 的表达水平有显著的负相关性（r=-0.325，P＜0.001）。

4、乳腺癌组织中Ki-67、EGFR、E-cad 的表达水平与乳腺癌预后评价体系Neo-bioscore相关性的研究

Neo-bioscore 评分体系分值高低与Ki-67 的表达水平有紧密正相关性（r=0.324，P＜0.001）；与EGFR 的表达水平有紧密性一般的正相关（r=0.176，P=0.023）。 而Neo-bioscore 评分体系分值高低与E-cad 的表达水平亦有紧密性一般的负相关（r=-0.162，P=0.037）。见表1。

表1 乳腺癌患者预后评价体系Neo-bioscore评分与Ki-67、EGFR、E-cad表达水平的相关性（例）

5、乳腺癌组织中Ki-67、EGFR、E-cad 的表达与患者生存分析

结合临床随访资料，对167 例患者的临床病例参数进行归纳总结（表2），术后常规定期随访，共14～88 个月的随访期（随访的平均时长40个月，34个月为中位数）。

表2 167例乳腺癌患者生存曲线单因素分析（Log-rank检验）

通过Kaplan-Meier单因素分析显示：乳腺癌的Ki-67表达水平和Neo-bioscore 评分是影像乳腺癌预后的因素（图1、图2）。乳腺癌Ki-67 表达水平不同其预后有明显差异（χ2=3.950，P=0.047），Neo-bioscore 评 分（χ2=13.372，P=0.004）。本研究中肿瘤位置、淋巴结转移、TNM 分级及其余生物学免疫因子对乳腺癌生存期的影响差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图1 167例乳腺癌患者Ki-67表达水平与生存时间的相关性分析

图2 167例乳腺癌患者Neo-bioscore评分与生存时间的相关性分析

进一步采用COX 模型排除混杂因素影响，分析Ki-67 表达水平和Neo-bioscore 评分实际值与生存时间的关系，结果显示Ki-67 表达水平和Neo-bioscore 评分仍是影响患者生存的独立危险因素（表3）。

表3 167例乳腺癌患者生存曲线多因素分析（COX回归）

讨 论

1、不同年龄对乳腺癌患者生存期的影响

本研究中，167例乳腺癌患者的平均发病年龄为46.4岁（年龄21～79 岁）。年轻乳腺癌（≤35 岁）以及老年乳腺癌（≥56 岁）比例分别为18.0%和18.6%，年龄分布特征与国内外相关研究［4］结果比较，年轻乳腺癌较国内外相关研究比例较低，而老年乳腺癌却得到了相似结果。对发病者的年龄进行分析，人数最多的组别（61 例）为46～55 岁这一年龄范围，占36.53%，从这个数值来看，表明女性绝经前后为高发期，应对其予以重视。有研究显示：年轻与老年的乳腺癌患者预后效果均较差，而年轻女性乳腺癌患者往往有较高的不良预后指标，其中绝大部分选择保留乳房的手段进行治疗，相较于年龄更大的乳腺癌患者而言，存在较高的局部复发风险［5-7］。但值得一提的是，对Luminal 亚型乳腺癌进行分析，老年患者预后效果较差。本研究中，因样本量及医疗服务辐射区域有限，结果中年龄因素对乳腺癌生存期的影响差异无统计学意义。但在未来的研究中，全面评估年轻女性乳腺癌手术后患者，更好地了解影响年轻妇女乳腺癌发病率和病死率的种族、民族差异的因素，将有助于改善她们的预后情况。

2、Ki-67的表达与肿瘤长径关系

20世纪80年代，Gerdes等［8］经过长期研究和不断摸索，在其发表的成果中指出，Ki-67 为增殖细胞核抗原，和有丝分裂存在非常紧密的关系。当前，在临床检测肿瘤增殖活性的过程中，往往会将Ki-67 视为一种具有较高可靠性的指标。根据已有的研究结果来看，其和癌症患者存活率、肿瘤体积等存在一定的关联性［9］，正是因为如此，经常用于对癌症患者的预后、疗效进行预测和评估。本文在研究过程中，Ki-67 与肿瘤长径有一定的正向相关性，但紧密性一般（r=0.159，P=0.041），该结论与部分学者先前的研究结论部分一致［10］。分析其原因，笔者认为：对细胞增殖、分化而言，Ki-67 发挥了非常重要的作用，因Ki-67 与VEGF 呈正相关性，后者对血管的形成产生了明显促进作用，使得血管变得更加通透，便于供给营养，故肿块在其作用下，生长速度增快、体积增大，分化程度较高，同时生长方式较易呈现纵向生长。

3、Ki-67、EGFR与病理分子分型相关性

本研究中，Ki-67 与EGFR 的表达水平与病理分子分型中的Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 阳性（HR 阳性）、三阴型有明显相关性，其趋势表现为Ki-67与EGFR 的表达水平越高则三阴型的可能性越大。由于缺乏ER、PR、HER-2 的表达，TNBC 的临床特征为具有侵袭性生物学表现，靶向治疗不具有特异性，对内分泌治疗的敏感性也较低。从这个层面上来讲，相较于其他乳腺癌亚型而言，预后明显较差。而Ki-67 在TNBC 中的预后价值尚不清楚，也没有达成共识。Wu 等［11］经过研究发现，Ki-67 的高表达是切除后TNBC 较差的预后因素，与低表达率相比，Ki-67 临界值≥40%与更高的复发和死亡风险相关，但Ki-67 的最佳临界值尚不清楚。Keam 等［12］报道，接受高Ki-67 表达新辅助治疗的TNBC 患者有早期复发的模式。相比之下，Ki-67 低表达的亚组没有任何模式，提示Ki-67 高表达可能导致早期复发，提示其具有高增殖潜力。这一现象可能部分解释了为什么高Ki-67 表达仍然是新辅助治疗亚组的不良预后因素。

EGFR 属酪氨酸激酶的ErbB 家族［13］。根据近期相关研究，在癌症患者中，经常出现EGFR 酪氨酸激酶结构域突变、基因扩增等变化，使得EGFR 参与了不同类型肿瘤的发病和进展，而EGFR 的基因改变都与抗EGFR 药物反应的高概率相关，所以在胰腺癌、肺癌等癌症中，EGFR 发生过表达、突变，加快肿瘤进程产生，和耐药性存在一定的关联性［14］。TNBC 的患者中也有较大比例发生EGFR 过表达现象，因此对TNBC 患者而言，EGFR 抑制剂治疗可能为有效的治疗方式。在临床治疗中，EGFR单抗、联合免疫检查点、PRMT1 抑制剂等极有可能具有重要的推广价值［15-16］。因此，EGFR 可用于TNBC 预后评价，并在TNBC 治疗过程中，可发挥分子靶点的作用［17］。

4、Ki-67、EGFR、E-cad 三者关系及与乳腺癌预后评价体系Neo-bioscore的相关性

既往的文献中对乳腺癌中Ki-67、EGFR、E-cad 三者间关系的研究甚少，据本文的试验结果：Ki-67 与EGFR 的表达水平呈正向相关性，而EGFR 与E-cad的表达水平呈负向相关性。笔者分析：Ki-67 作为一种增殖标志物，似乎与癌症的存活率有关，也有研究认为它是检测肿瘤增殖活性的最可靠指标［9］；EGFR 对细胞增殖、分化产生影响［18］，其高表达极有可能加快恶性肿瘤的转移、复发，不管是总生存期，还是无病生存期，都出现了显著下降趋势。E-cad作为钙黏附蛋白家族中重要成员，是近年来的研究热点之一。作为肿瘤抑制因子的E-cad 与肿瘤的侵袭和转移密切相关，研究显示E-cad 在乳腺癌组织中呈低表达，且与ER 表达水平呈显著相关。E-cad 蛋白表达减少或缺失是导致恶性肿瘤转移中的一个重要因素。Stănculescu 等［19］发现在分化差、进展期的癌症中E-cad蛋白表达降低，转移病灶中E-cad蛋白表达均缺失。由此可见，Ki-67 与EGFR 同为影响肿瘤细胞增殖的免疫因子，其间的正相关性可以认为不是偶然；E-cad 蛋白作为抑癌因子与增殖因子EGFR 呈负相关性，也可能存在一定的内在关联，但需要更多的样本量支持和实验进一步验证。

Neo-bioscore 评分系统是将新辅助治疗前的临床分期、肿瘤穿刺病理信息（包括ER、PR、HER-2、组织学分级）、术后病理分期综合进行评分量化，各项评分相加最终得到Neo-Bioscore 得分，它几乎涵盖了乳腺癌新辅助治疗前、后重要的临床病理信息［20］。国内外有研究显示：对早期无病生存期进行预测时，以该得分为考察指标［21］。对复发风险进行分组时，如果阈值设定为3 分，与无病生存期的相关性更紧密，对年轻的HR阳性乳腺癌患者内分泌治疗方案的选择进行指导。Neo-Bioscore 除了可以改善新辅助化疗后乳腺癌患者在临床和病理分期上的预后分层［22］，并且可能有助于识别可以避免额外辅助化疗的非pCR TNBC 患者。本研究中，Neo-bioscore 评分体系分值高低与Ki-67、EGFR 的表达水平有正相关性，而与E-cad 的表达水平有负相关性。笔者认为：该结果从侧面证明，Ki-67、EGFR 等表达在评价乳腺癌患者疗效、预后分层时具有重要的指导意义。

5、乳腺癌的Ki-67 表达水平、Neo-bioscore 评分与生存时间的相关性

既往的研究中多次验证：乳腺癌的高增殖状态又导致与肿瘤的浸润生长和转移有相关性［23］，所以，Ki-67 高表达和乳腺癌患者不良预后存在非常密切的联系。焦武等［24］在研究过程中，Neo-bioscore 评分阈值设置为3分，对198例患者进行分组，按照高、低分组开展生存分析，结果差异有统计学意义（χ2=17.353，P＜0.05），这与本研究中Neo-bioscore评分的生存分析结果相似（χ2=13.372，P=0.004）。但这一预后评分体系并未将Ki-67 表达水平纳入参考范围［25］，虽然在预后评估方面有着全面、分层清晰、早期评估效果好等优越性，但临床对Ki-67 的参考应用较多，这也可能会在某种程度上会影响对乳腺癌预后评估的判定，加之评分标准较为复杂，国内外很多专家学者也在不断改良。故笔者认为，将Ki-67 表达水平与Neo-bioscore 评分结果综合评估乳腺癌患者的生存预后，可能更会合理地预测乳腺癌患者的生存情况及预后。

6、本研究的创新点及局限性

本研究首次在乳腺癌中综合研究免疫因子Ki-67、EGFR、E-cad表达水平之间的相互关系，以及与乳腺癌预后的相关性，并首次将其与乳腺癌预后评价体系Neo-bioscore评分进行比较，确定其对部分乳腺癌亚型靶向治疗预后评价的价值分析，此方法国内外发表的文献中尚未见报道。

本文在研究过程中存在一些缺陷：首先，由于设置了相对严格的纳入标准，有可能导致选择存在偏倚现象；与此同时，随访的中位时长为3 年，导致整体层面上的病死率、复发率被低估，应该延长随访时间，更好地对治疗乳腺癌患者过程中的这些因素价值进行验证。

从以上分析来看，本文经过研究，发现Ki-67、EGFR 及E-cad表达对增殖活性分子表达等产生了辅助判断作用，使得个性化、靶向治疗成为可能，与乳腺癌患者的预后有直接或间接相关性，动态监测肿瘤靶向治疗效果，从而更好地为临床服务。