李光月，李雪玲，祁姣姣，朱剑锋，赖美连，胡文锋,,

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.生物源生物技术（深圳）股份有限公司，广东深圳 518118）

表面活性素（Surfactin）是一种分子量大小约为1.036 kDa的两亲性环状脂肽，是由芽孢杆菌属在对数生长期和/或稳定生长期产生的次级代谢产物[1]。表面活性素的生物合成途径主要受表面活性素的生物合成途径主要受srfA操纵子编码的非核糖体肽合成酶（NRPS）调控[2]。表面活性素具有LLDLLDL手性七肽的亲水肽链的“头部”，C12-C19（以C13-C15为主）的疏水性β-羟基脂肪酸的“尾部”组成，形成分子的环状结构。自1968年Arima等[3]在几株枯草芽孢杆菌的培养液中发现表面活性素后，经过50多年来的研究，学者们不断挖掘出表面活性素具有诸多独特的优势，如能有效地乳化和降低水的表面张力[4]、抗细菌[5]、抗真菌[6]、抗病毒[7]、抗炎[8]以及抗癌症[9]等。因此，表面活性素是一种具有应用价值的微生物脂肽，在食品、石油、农业、畜牧业和制药等领域有着广泛的应用前景。此外，表面活性素并不是一个单体，通常是混合物，具有多种同系物，这是由脂肪酸的不同碳链长和肽链的氨基酸序列的可变性所导致的。迄今为止，人们已经精确地测定了十余种表面活性素同系物[10]。

目前，表面活性素还没有实现工业化生产，主要存在两个问题：产量低和分离纯化成本高，而进行发酵条件优化是解决上述问题的主要途径之一[11]。不少研究通过优化发酵条件，提高菌株产表面活性素的能力。Prado等[12]研究了碳源对Bacillus subtilisICFPC产表面活性素的影响，利用碱性预处理提取的半纤维素玉米芯液作为碳源，表面活性素产量可达到3.95 g/L。萎缩芽孢杆菌5-2a以甘露醇是唯一的碳源时，培养上清液的最低表面张力为25.82 mN·m-1[13]。在另一项研究中，铜绿假单胞菌NCIM 5514在以10 g/L的葡萄糖作为碳源的培养基中培养96 h后，表面活性素产量为3.0 g/L[14]。本文以前期筛选获得的表面活性素高产菌株枯草芽孢杆菌FHYB201030为出发菌株，通过单因素实验、Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计优化菌株FHYB201030的培养条件和发酵培养基，为枯草芽孢杆菌FHYB201030工业化生产表面活性素提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌FHYB201030 由华南农业大学食品学院应用微生物实验室提供；Surfactin 纯度≥98%，Sigma公司；氯化十六烷基吡啶、溴百里酚蓝、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等 均为分析纯，广东环凯微生物科技有限公司；营养肉汤培养基（NB） 牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蛋白胨1 g、蒸馏水1 L，pH7.0～7.2，广东环凯微生物科技有限公司。

SpectraMax M2多功能酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；SW-CJ-IF超净工作台 苏州净化设备有限公司；SPH-200恒温培养振荡器 上海世平实验设备有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪日本岛津公司；COSMOSIL 5C18-AR-II 色谱柱（4.6×250 mm） 日本Nacalai Tesque公司。

1.2 实验与方法

1.2.1 表面活性素的发酵工艺 全文优化前菌株用的基础培养基为NB培养基，基础培养条件为转速（180 r/min）、培养温度（37 ℃）、接种量（体积比为3%）、装液量（体积比为30%）、培养时间（72 h）。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 碳源对表面活性素产量的影响 在NB培养基的基础上分别添加不同碳源（淀粉、糊精、甘油、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、玉米粉、蔗糖），终浓度均为20 g/L，基础培养条件下发酵72 h，测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.2 氮源对表面活性素产量的影响 在NB培养基的基础上分别添加不同氮源（豆粕饼粉、酵母提取物、酪蛋白、棉籽饼粉、尿素、柠檬酸铵、氯化铵和硫酸铵），终浓度均为10 g/L，基础培养条件下发酵72 h，测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.3 金属离子对表面活性素产量的影响 在NB培养基的基础上分别添加不同金属离子（Cu2+、K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Zn2+），终浓度均为0.5 mmol/L，基础培养条件下发酵72 h，测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.4 氨基酸对表面活性素产量的影响 在NB培养基的基础上分别添加不同氨基酸（Asp、Cyc、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Phe、Val），终浓度均为1 g/L，基础培养条件下发酵72 h，测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.5 装液量对表面活性素产量的影响 将对数期的菌液分别接种于不同装液量（10%、20%、30%、40%、50%）的培养基中，保持其他条件不变，发酵72 h后测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.6 发酵温度对表面活性素产量的影响 将对数期的菌液接种于培养基中，分别在不同发酵温度（27、32、37、42、47 ℃）发酵72 h，保持其他条件不变，测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

1.2.2.7 转速对表面活性素产量的影响 将对数期的菌液接种于培养基中，分别在不同转速（140、160、180、200、220 r/min）的保持其他条件不变，发酵72 h后测其生物量和CPC-BTB数值，以基础培养条件下发酵的数值为对照组。

图 1 碳源对表面活性素产量的影响Fig.1 Impact of carbon source on the production of surfactin

1.2.3 Plackett-Burman试验 在单因素结果的基础上筛选出对表面活性素产量影响较显著的因素，使用Design-Expert.V 8.0.6进行N=12（10个因素，1个虚拟项）的Plackett-Burman实验设计和结果分析。以CPC-BTB数值为响应值，每个因素取高（+1）、低（-1）两个水平，保留1个虚拟变量用来评估实验误差，每个实验重复三次，取平均值作为响应值。各因素及水平详见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验结果，综合考虑各因素效应正负和试验成本来设计最陡爬坡试验中各因素的步长和爬坡方向。

1.2.5 响应面试验 根据Plackett-Burman试验结果，以最陡爬坡试验的最优条件为水平中心，使用Design-Expert.V8.0.6进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计（表2）。

1.2.6 模型的验证 利用响应面模型优化的最佳条件进行发酵实验，比较模型预测值与实验值，验证模型的有效性，实验重复3次，取平均值，并利用高效液相色谱法测定枯草芽孢杆菌分别在优化前和优化条件下产生的表面活性素的含量。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1 生物量的测定 通过使用SpectraMax M2多功能酶标仪，利用比浊法测定枯草芽孢杆菌发酵液适宜比例稀释液的OD600 nm值，评价不同条件下枯草芽孢杆菌的生长情况。

1.2.7.2 CPC-BTB比色法 CPC-BTB比色法测定表面活性素的相对含量[15-16]，配制0.2 mmol/L CPC（氯化十六烷基吡啶）和0.2 mmol/L BTB（溴百里酚蓝）后，等体积混合在0.1 mol/L PBS（磷酸缓冲溶液，NaH2PO4/Na2HPO4，pH8.0）中，制备成CPC-BTB溶液。在酶标板内分别加入25 μL不同浓度表面活性素标准品（50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μg/mL），待标品加完后，用100 μL的排枪快速加入100 μL CPC-BTB溶液/孔，25 ℃下反应5 min，使用酶标仪测定其OD600。用标准曲线判断其产量。

测定表面活性素的标准曲线的线性决定系数R2=0.98425，具有一定的线性关系，可作为一种判定表面活性素相对含量的指标。

1.2.7.3 高效液相色谱法 发酵液先经离心，然后采用0.22 μm微孔滤膜过滤，最后注入HPLC中进行测定，检测采用紫外检测器，色谱柱：COSMOSIL 5C18-AR-II（4.6×250 mm，日本Nacalai Tesque公司）；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；检测波长：205 nm；流速：0.84 mL/min；溶剂：水（含0.1% TFA）:乙睛（含0.1% TFA）=90:10。

测定表面活性素的标准曲线的线性决定系数R2=0.9972，相关性良好，可用此方法测定样品中表面活性素的含量。

1.3 数据处理

每组实验重复3次，取平均值。数据采用Origin-Pro 9.0软件进行统计分析，Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验设计。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 碳源对表面活性素产量的影响 据报道，不同碳源不仅会影响菌株所产生的生物表面活性剂的产量，还会对由特定微生物菌株合成的生物表面活性剂的同系物造成影响[17]。由图1可知，碳源不同，枯草芽孢杆菌FHYB201030的生物量和表面活性素产量相差较大。其中，以乳糖、甘油、麦芽糖为碳源时，枯草芽孢杆菌FHYB201030的生物量较高，分别为5.01、4.04和4.11；以乳糖、山梨醇、麦芽糖为碳源时，枯草芽孢杆菌FHYB201030产表面活性素量较高，分别为0.22、0.21和0.20；以乳糖为碳源时，枯草芽孢杆菌FHYB201030的生物量（5.01）和表面活性素的产量（CPC-BTB值为0.22）都达到最高值。选择的碳源为乳糖、麦芽糖以及山梨醇。

2.1.2 氮源对表面活性素产量的影响 氮源是微生物生产表面活性素所需的第二重要营养素，不同的无机和有机氮源会影响表面活性素的合成，比如酵母提取物、硝酸铵、硫酸铵、尿素蛋白、硝酸钠和麦芽提取物等[18]。根据图2的结果，氮源的种类很大程度影响着菌株的生物量和表面活性素的产量[19]。当以豆粕饼粉和棉籽饼粉为氮源时，生物量达到4.25和4.08，而酵母提取物、酪蛋白作氮源时，表面活性素产量较高，CPC-BTB值分别为0.18和0.19。相对而言，有机氮源对该菌株的生物量和表面活性素产量影响更大，最终选择酵母提取物和酪蛋白作为氮源进行后续优化试验。

图 2 氮源对表面活性素产量的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on the yield of surfactin

图 3 金属离子对表面活性素产量的影响Fig.3 Influence of metal ions on the production of surfactin

2.1.3 金属离子对表面活性素产量的影响 不同的金属离子可能会通过复杂的过程（包括细胞生长增强，氮利用受到影响以及其他可能未知的机制）明显影响表面活性素的产量，例如Mg2+、K+、Mn2+和Fe2+这4种金属离子在表面活性素的合成中尤为重要[20]。根据图3的结果，除了Fe3+，其他金属离子对枯草芽孢杆菌FHYB201030的生长具有不同程度的抑制作用；除了Zn2+之外，其他金属离子对表面活性素产量都有一定的促进作用，其中，Mn2+对提高表面活性素产量的影响最显著，CPC-BTB值达到0.14，因此选择添加Mn2+进行后续试验。

2.1.4 氨基酸对表面活性素产量的影响 多项研究表明，氨基酸的添加会影响脂肪酸的生物合成，进而影响表面活性素的生物合成[21]。比如，枯草芽孢杆菌发酵81 h后，向发酵培养基中添加Glu，其脂肽产量提高了6倍[22]。图4结果显示，在发酵培养基中添加不同氨基酸会对菌株的生长和表面活性素产量有一定的影响。当添加组氨酸（His）和亮氨酸（Leu）到培养基中时，菌株的生物量（1.97和1.99）高于其他氨基酸的添加，但是表面活性素的产量（CPC-BTB值为0.09和0.08）偏低。表面活性素分子中含有四种氨基酸，分别是亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和缬氨酸（Val），除了Leu，额外添加Glu、Asp和Val均能提高表面活性素的产量，其中额外添加Asp和Glu比添加其他氨基酸更能促进菌株合成表面活性素，CPC-BTB值分别达到0.14和0.13，推测的原因是Leu会促使菌体内物质代谢和能量代谢更多流向菌体的生长。鉴于以下三点原因，综合考虑，选择添加Glu进行后续试验：a.天冬氨酸的酸性比谷氨酸强，不利于培养基的pH调节；b.谷氨酸的水溶性比天冬氨酸的高，更利于细菌的利用；c.天冬氨酸可以通过谷氨酸转化而来。

图 4 氨基酸对表面活性素产量的影响Fig.4 Effect of amino acids on the production of surfactin

2.1.5 装液量对表面活性素产量的影响 在摇瓶培养条件下，可以通过改变摇床转速或装液量来调节溶氧量。有研究表明，当转速为250 r/min时，产表面活性素最佳的装液量为20%，但如果装液量大于20%时，则会在培养基上限制氧气，将导致生物量和生物表面活性剂在250 r/min时的减少[23]。结果如图5所示，在装液量为10%时，生物量的数值（1.37）最高，枯草芽孢杆菌为好氧菌，装液量大会致使溶氧不足，从而抑制菌体呼吸，导致生物量低；而当装液量为30%时，产生的表面活性素量最高，CPC-BTB数值达到0.1。过低（发酵后期营养供给不足）和过高（溶氧量低）的装液量都会影响表面活性素的合成。选择的装液量为30%。

2.1.6 发酵温度对表面活性素产量的影响 温度对菌体代谢的影响主要是通过影响酶的活性，改变菌体代谢方向或影响代谢的速率，从而影响菌体的生长和代谢产物的含量。实验结果如图6所示，当温度为47 ℃时，菌体的生物量（1.46）和表面活性素产量（CPC-BTB值为0.14）较高，27 ℃的低温导致菌体生长过慢，降低发酵产量。多数报道的表面活性素生产的适宜温度为25～37 ℃[24]，汤颖秀[25]的研究发现，30 ℃为菌体生产表面活性素最佳温度，产量达到0.89 mg/mL。选择的温度为47 ℃。

图 5 装液量对表面活性素产量的影响Fig.5 Influence of liquid loading on the output of surfactin

图 6 发酵温度对表面活性素产量的影响Fig.6 Influence of fermentation temperature on the yield of surfactin

2.1.7 转速对表面活性素产量的影响 对于枯草芽孢杆菌这种好氧菌而言，摇床转速主要通过影响发酵过程中的溶氧量来调节菌体的代谢过程[26]。转速对表面活性素产量的影响见图7，整体上，转速对该菌株的代谢影响不是很明显。基本上改变转速对生物量几乎没影响，但是对表面活性素产量有一定的影响，其中，当转速为200 r/min时，菌体产生的表面活性素的量最大，CPC-BTB值达到了0.11。转速从140升至200 r/min过程中，氧气和培养基的接触面积和接触时间增大，提高溶氧量，促进了菌体代谢产物的合成。当转速从200升至250 r/min时，表面活性素产量反而降低，推测是因为溶解氧太多，影响代谢过程中关键酶的活性，反而抑制表面活性素的形成。选择的转速是200 r/min。

图 7 转速对表面活性素产量的影响Fig.7 Influence of speed on the production of surfactin

2.2 Plackett-Burman 试验结果

根据单因素实验结果，确定研究因素和水平后，按照表1对发酵条件中10种因素进行考察，以筛选出对表面活性素产量影响显著的因素作进一步优化。Plackett-Burman实验结果及方差分析如表3和表4所示。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3 Plackett-Burman design and results

从表4可知，PB试验的模型P值为0.0113，小于0.05，失拟项的P值为0.3807，大于0.05，表明该模型具有统计学意义。从各个因素的P值可知，温度、乳糖和Glu对CPC-BTB值影响极显著（P值＜0.01），其余7种因素对CPC-BTB值影响不显著（P值＞0.05）。根据表4的各因素预估系数可知，乳糖对CPC-BTB值表现为正效应，温度和Glu表现为负效应。因此，根据P值和因素的正负效应进行下一步的最陡爬坡试验。

表4 Plackett-Burman试验方差分析Table 4 Analysis of variance in Plackett-Burman test

2.3 最陡爬坡试验结果

根据因素的正负效应和实际情况确定爬坡试验中各因素的爬坡方向和步长，具体设计及结果详见表5。由表5可知，第2组实验的CPC-BTB值最高，为0.34，故以此为CCD实验的水平中心。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent method

2.4 响应面试验

根据PB试验和最陡爬坡试验结果，以CPC-BTB值为响应值，以（乳糖20 g/L、温度32 ℃、Glu 2.0 g/L）为中心点，对BBD试验设计的结果建立回归模型并进行方差分析，结果见表6～表 7。方差分析结果显示，所选择的回归模型的P＜0.0001，R2=0.9927，校正相关系数为0.9834，表明该模型对试验结果影响极显著，可信度很高；而失拟项P=0.2089＞0.05，失拟项不显著，该回归模型的拟合度很高，可以充分说明试验因子与响应变量之间的函数关系。由P值可得出，因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2对CPC-BTB值影响极显著（P＜0.01），其余因素对CPC-BTB值影响均不显著（P＞0.05）；说明单因素作用和交互作用对CPC-BTB数值均有显著的影响。CPC-BTB值（Y）对乳糖、温度、Glu的多元二次回归方程为：Y=0.52-0.075A+0.00875B-0.056C+0.0025AB-0.038AC+0.02BC-0.078A2-0.021B2-0.056C2。通过方程可知，二次项系数为负值，表明方程具有最大值。

表6 Box-Behnken试验设及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken test

表7 Box-Behnken试验方差分析Table 7 Analysis of variance in Box-Behnken test

3D图形和等高线图表示，图的颜色从蓝色到红色的变化表示提取质量CPC-BTB值从低到高的变化，变化的越快表示坡度越大，即对试验结果的印象更为显著，响应面等高线图可以直观地反映各因素对响应值的影响，以便找出最佳发酵参数以及各参数之间的相互作用，等高线中的最小椭圆的中心点即是CPC-BTB值的最高点。根据回归方程绘出的各因素相互作用的3D图形和等高线图见图8～图10。

根据图8结果显示，温度和乳糖的交互作用对响应值CPC-BTB值的影响，从响应曲面看，二者曲面均有一定的弧度，温度曲面大于乳糖曲面，表明温度对CPC-BTB值的影响略显著于乳糖。从等高线看，该形状明显趋于圆，表明温度和乳糖之间的交互作用较弱。图9为当乳糖取0水平时，温度和谷氨酸的交互作用对CPC-BTB响应值的影响。二者曲面均较为陡斜，当温度一定时，CPC-BTB值随谷氨酸增加呈现先增后减的变化；同理，当谷氨酸一定时，CPC-BTB值随温度增加呈现先增后减的变化；而等高线形状也趋于椭圆，说明两者的交互作用对CPCBTB值显著。在图10显示的谷氨酸和乳糖交互作用中，抛物线图呈开口朝下，等高线图椭圆状明显，说明两者的交互作用对CPC-BTB值显著。综上所述，3个因素对CPC-BTB值的影响显著性顺序为：温度＞谷氨酸＞乳糖，与方差分析的结果保持一致。

图 8 温度和乳糖的交互作用对CPC-BTB值的影响Fig.8 Effects of temperature and lactose interaction on CPCBTB values

图 9 温度和谷氨酸的交互作用对CPC-BTB值的影响Fig.9 Effect of temperature and glutamic acid interaction on CPC-BTB value

图 10 谷氨酸和乳糖的交互作用对CPC-BTB值的影响Fig.10 Effect of interaction between glutamate and lactose on CPC-BTB value

通过Design-Expert.V8.0.6软件分析，得出最优发酵条件为：乳糖25 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2.5 g/L；温度40 ℃、转速200 r/min、装液量30%（体积比）。

2.5 验证试验

为了验证模型的准确性，根据预测最优条件（乳糖25 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2.5 g/L；温度40 ℃、转速200 r/min、装液量30%（体积比））进行3次重复试验，测定的CPC-BTB值为0.5195（SD=0.0036），实际值与预测值结果接近，说明构建的模型可靠，能够准确预测真实值。

3 结论

以CPC-BTB数值为评价指标，以枯草芽孢杆菌FHYB201030为试验菌株，通过单因素实验和Plackett-Burman试验，筛选出3个显著影响菌株产表面活性素含量的因素，分别为温度、乳糖和Glu；利用最陡爬坡设计逼近产表面活性素最大区域，确定中心组合试验的中心位点，方便进行下一步的BBD设计试验；进行Box-Behnken因子设计，优化产表面活性素的发酵条件，优化后获得的最佳培养基配方：乳糖20 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2 g/L；最佳发酵条件为：温度40 ℃、转速200 r/min、装液量30%。在该发酵条件下，实测CPC-BTB值为0.5195，与预测值的0.51714接近，最终表面活性素的产量基本维持在0.48 mg/mL，比优化前（0.35 mg /mL）提高34.56%。最终得到的最优发酵条件为菌株FHYB201030合成表面活性素的规模化生产奠定了基础。