雷栓虎 郭丽 管晓鹂 张霞 岳海源 周斌 刘京升 汪玉良

1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干细胞家族的重要成员，主要存在于生物体的骨髓中。BMSCs 分化能力较强[1］，不仅可分化为造血细胞，还可分化为成骨细胞[2］、神经细胞[3］等。BMSCs 取材方便，容易培养纯化，可以作为良好的种子细胞[4］，通过细胞移植在生物医学工程领域发挥重要作用[5，6］，已有报道将BMSCs 用于治疗多种疾病，例如骨发育不全症、黏多糖症等[7，8］。

骨折不愈合或延迟愈合在临床中很常见，严重影响了患者的康复和生活。BMSCs 已经证实在体内外诱导培养下可以分化为成骨细胞。本实验设计将自体染色标记的BMSCs 移植于骨折部位，观察其对骨痂形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD 大鼠，体重160～230g，6～8 周龄，SPF 级，购自兰州大学实验动物中心（动物质量合格证号：SCXK 甘2013-0002），动物保护协议经《兰州大学实验动物使用伦理委员会》批准。

1.2 实验试剂 5-溴脱氧尿嘧啶核（BrdU）（Sigma 公司）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma 公司）、IX70 倒置相差显微镜（Olympus 公司）、0.9 mm 的克氏针和微量注射器（上海医用公司）、游标卡尺（Mitutoyo corporation）、X 光机（型号：SIEⅧNS mX）、ABl04 一N 型电子秤（梅特勒公司），精确度0.01mg。

1.3 实验方法

1.3.1 BMSCs 的原代分离与培养[9，10］。取SD 大鼠一只，颈椎脱臼法处死，将大鼠移入超净工作台内，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，用DMEM/F12 培养液冲洗股骨、胫骨骨髓，配制细胞悬液。按照细胞培养方法依次接种、培养、传代。

1.3.2 BMSCs 的形态学观察。镜下观察BMSCs 生长、增殖情况并记录。

1.3.3 BMSCs 表面标志检测。0.25%的胰蛋白酶和1mm MEDTA 在37℃中孵育第三代BMSCs 3 到4min，然后按照1×105个/mL 的浓度接种。PBS 洗涤细胞后加入鼠单克隆抗体（抗CD34、抗CD44、抗CD45）在4℃的暗室中孵育30 min，PBS 洗涤2 次，离心弃上清液，加入PBS 重悬，用流式细胞仪检测目标细胞。

1.3.4 BrdU 的体外标记与检测。取第三代BMSCs，以1×105个/mL 的浓度接种于96 孔板中，在细胞生长融合前48h，以浓度为10μmol/L 的BrdU 标记BMSCs，孵育至细胞融合，免疫组化染色。

1.3.5 DAPI 的体外标记与检测。取第三代BMSCs，以1×105个/mL 的浓度接种于96 孔板中，在细胞生长融合前30min，以浓度为20μg/mL 的DAPI 标记BMSCs，孵育至细胞融合，测定DAPI。

1.3.6 MTT 法检测细胞增殖力。加入20μL（5mg/mL）的MTT，在37℃下孵育4 小时后加入150μL 二甲基亚砜，轻轻晃动溶解细胞代谢产物，调零后检测490 吸光度值。

1.3.7 动物模型的建立。SD 大鼠麻醉后仰卧位固定，左胫骨消毒，切开皮肤，在胫骨中断逐层分离暴露，摆锯横行截断胫骨中段，采用克氏针髓内固定骨折断端，造模成功后逐层缝合关闭切口，术后石膏辅助固定。

1.3.8 实验分组与BMSCs 标记移植。24 只SD 大鼠随机分为三组（n=8），A 组为单纯左胫骨骨折组，B 组为左胫骨骨折+DMEM 组，C 组为左胫骨骨折+BMSCs 移植组。术前两周C 组取自体BMSCs，待模型建立两天后，将BrdU 标记好的BMSCs 配成细胞悬液，密度为1×107/mL，在骨折断端周围2mm 处注入50μL 细胞悬液。同时B 组局部注射等量DMEM。术后分别于1、2、3、4 周于左胫骨骨折部位取材，石蜡包埋后切片，行免疫组化检测。

1.3.9 胫骨DR。分别于术后1、2、3、4 周拍摄左侧胫骨正、侧位片，游标卡尺（精确度0.01mm）测量骨痂宽度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件对数据行单因素方差分析，数据以±s 表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 的分离、培养和扩增 实验中，细胞期初呈悬浮状态，圆形，较为混杂，24h 后细胞开始贴壁，48h 换液后细胞形态呈多样化，1 周后可见BMSCs 开始形成细胞克隆，呈梭形的铺路石样外观。当细胞融合达到80%左右时，进行细胞传代，传至第三代时，细胞形态均匀、统一，呈长梭形。见图1。

图1 第三代BMSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×200）

2.2 流式细胞仪检测BMSCs 免疫表型 培养至第三代的BMSCs 免疫表型分别为CD44 81.27%（图2A）、CD34 2.32%（图2B）、CD45 0.35%（图2C）。结合BMSCs的生物学特性及免疫表型的表达结果，证明实验中成功分离出了高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞[11，12］。

图2 流式细胞仪检测BMSCs 免疫表型

2.3 BrdU 染色标记BMSCs 取生长状态良好的第三代BMSCs，在细胞生长融合前48 h，以浓度为10μmol/L的BrdU 染色细胞。结果可见超过95%的BMSCs 阳性表达（图3）。相差显微镜下观察BMSCs，细胞生长良好。

图3 BrdU 染色标记BMSCs（倒置相差显微镜×200）

2.4 DAPI 染色标记BMSCs 取生长状态良好的第三代BMSCs，在细胞生长融合前30min，以浓度为20μg/mL的DAPI 染色细胞，结果可见超过98%的BMSCs 阳性表达（图4）。相差显微镜下观察BMSCs，见细胞生长良好。

图4 DAPI 染色标记BMSCs（倒置相差显微镜×200）

2.5 胫骨DR 骨痂测量 术后第1、2 周时A、B、C 三组骨折断端骨痂较少，骨折线清晰可见（图5），三组实验动物骨痂宽度无明显差异（P＞0．05）；在术后第3、4周时，A、B、C 三组骨折线逐渐模糊，断端有较多骨痂包绕，但C 组骨折断端骨痂明显多于A、B 两组，骨小梁丰富，骨折趋于愈合，骨痂宽度较A、B 两组有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图5 术后第三周三组DR 摄片

图6 胫骨DR 骨痂测量

3 讨论

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是干细胞家族的重要成员之一，分离、纯化的BMSCs 对生物组织工程及再生医学具有重要意义。目前，BMSCs 分离、纯化方法主要有密度梯度离心法[13］、贴壁细胞分离法[14］、流式细胞仪和免疫磁珠分离法（MACS）[15］。后两种方法代价昂贵、操作复杂，难以广泛开展，pittenger 报道的密度梯度离心法耗时较多，细胞损伤和污染发生率较高[16］，因而也较少使用。贴壁细胞分离法是根据干细胞黏附、贴壁的特性来剔除其他悬浮生长的杂细胞，该方法简单、有效，多次传代后可获得纯度较高的BMSCs。本次实验中，我们选用该方法来分离和纯化BMSCs，效果良好。

BMSCs 的鉴定方法主要是通过检测细胞免疫表型并结合其生物形态的特征来确定。在本次实验中，我们检测到目标细胞CD44 表达阳性，而CD45 和CD34阴性，结合细胞形态呈均匀的长梭形，因此，实验结果证明我们成功的分离、培养出了BMSCs[17］。

BrdU 是一种嘧啶类似物，其检测准确性高，标记率高，安全简便，BrdU 和靶细胞DNA 结合后经过免疫组化染色可呈现绿色荧光。在本次实验中，我们选用标记时间为48 小时，终浓度为10μmol/L 的BrdU 染色靶细胞，其有效标记率大于95%，同时MTT 检测实验组细胞生长状态良好。实验结果表明，利用BrdU 检测跟踪移植后细胞动态变化是一种很好的方法[18］。

DAPI 与目标细胞的双链DNA 结合后能产生比其自身强20 多倍的荧光，DAPI 也可以和RNA 结合，但产生的荧光强度较弱。在本次实验中，我们选用标记时间为30 分钟，终浓度为20μg/mL 的DAPI 染色靶细胞，其有效标记率大于98%，同时MTT 检测实验组细胞生长状态良好。实验结果表明，DAPI 是一种简单、方便的细胞标记方法，其标记效率高，而且无细胞毒性[18］。

骨折的愈合是一个非常复杂的过程，临床实际工作中，骨折不愈合或延迟愈合很常见，这严重影响了患者的康复锻炼和早日回归社会。BMSCs 已经证实在体内外诱导培养可以分化为成骨细胞。那么，将BMSCs移植在骨折处是否会促进骨折的愈合。因此，本实验将自体染色标记的BMSCs 移植于骨折部位，观察其对骨痂形成的影响。

骨折的愈合不仅需要良好的固定、制动，同时与周围神经也有密切的关系[19，20］，周围神经通过释放某些神经介质调节骨折的愈合过程。此外，骨折断端的血运条件对其愈合也很关键，有研究发现[21］神经肽物质CGRP 具有调节血管舒张，增加骨折断端血运，加速骨折愈合的作用。

BMSCs 可以分化为多种细胞[22］，既往许多自体骨髓移植动物实验结果表明：骨髓移植能促进骨愈合[23］。本实验通过使用大鼠BMSCs 自体移植，探索其对骨折愈合的影响。

本实验研究发现，在术后第1、2 周时（血肿炎症机化期），实验动物骨折断端骨痂包绕较少，骨折线清晰可见，三组实验动物骨痂宽度无明显差异，在术后第3、4 周时（骨痂形成塑形期），A、B、C 三组实验动物骨折线逐渐模糊，断端开始逐渐有较多骨痂包绕，但C 组骨折断端骨痂明显多于A、B 两组，骨小梁丰富，骨折趋于愈合，骨痂宽度较A、B 两组有统计学意义（P＜0.05）。上述实验结果表明：大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）自体移植对骨折愈合有积极促进作用，其机制可能是BMSCs 在骨折处聚集，同时受到体内环境及各种因子诱导，改变了成骨细胞及破骨细胞之间的动态平衡，从而影响了骨折愈合的进程。但是，骨折愈合受诸多因素的影响，是一个极其复杂的过程，其具体修复机制还有待进一步研究。