◎ 种 婷

（辽宁省检验检测认证中心，辽宁 沈阳 110032）

1 蜡样芽孢杆菌的危害

蜡样芽孢杆菌是一种普遍存在于自然环境中的细菌，如存在于土壤、空气、水中等，是芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，可产生内孢子。蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占全球所有食物中毒事件的1.4%～12.0%，2018年欧盟有98起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件，蜡样芽孢杆菌毒素继沙门氏菌、弯曲杆菌、诺如病毒和金黄色葡萄球菌之后排在第5位[1-2]。2018年中国疾病预防控制中心卫生应急中心发布的我国食物中毒事件数据显示，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒事件总数和中毒总人数的5.61%和6.80%，仅次于沙门氏菌、副溶血性弧菌、致泄大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素，位列第5位[3]。关于蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide引起的食物中毒报告越来越多，由于呕吐毒素Cereulide是原料中的蜡样芽孢杆菌在生长过程中预先形成的，因此在某些中毒事件中只检测到Cereulide，没有分离出蜡样芽孢杆菌[4]。

2 呕吐毒素Cereulide的特性

Cereulide最初由AGATA等[5]发现，是一种环状十二肽，由6个α-氨基酸和6个α-羟基酸组成，基本的氨基酸序列为[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-DVal]3。其结构特点是肽和酯键交替键合（图1），具有高度亲脂性和极强的耐热性，在pH值为2～11范围稳定，在121 ℃下持续2 h后也不会失去活性，它对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抵抗力，不会在通过宿主胃时失活。由于其分子量为1.2 kDa，不能通过食品加工中的常规灭菌方式（如真空除菌或过滤）去除，也不会通过热处理使其失活，所以Cereulide几乎不能被去除或灭活[6]。因此，防止其在食品生产和加工中合成至关重要。

3 呕吐毒素Cereulide的合成及影响因素

Cereulide由一种非核糖体肽合成酶（Non-ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）合成，称为Ces-NRPS[7]。NRPS是大型模块化多酶复合物，编码Cereulide合成酶的基因位点显示了NRPS基因团的典型结构。ces基因在pCER270巨型质粒上编码，该质粒与来自炭疽杆菌的pXO1毒素质粒类似[8]。24 kb ces基因团总共包含7个编码序列。cesA和cesB是结构性合成酶基因，除了结构合成酶基因外，相应的基因位点通常包含参与激活NRPS的基因，在ces基因的5'端有cesH一种功能未知的水解酶；cesP一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Phosphopantetheinyl Transferase，PPtase），参与合成酶的活化；cesT是一种II型硫酯酶，被认为与去除错误引发的单体有关。在ces基因的3'端，有两个编码序列，称为cesC和cesD，编码ABC转运蛋白。转运子ABC不仅负责转运毒素，并且将cesA、cesB合成酶固定在细胞膜上，在Cereulide生物合成中发挥重要作用[9]。

有研究发现，染色体上的关键转录因子cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD在合成Cereulide上起着关键作用。LÜCKING等[10]对蜡样芽孢杆菌F4810/72的缺失突变体进行研究，发现ces基因不受PlcR的控制，ces基因受Spo0A-AbrB控制。spo0A的sigma（A）驱动的转录对Cereulide合成至关重要，而spo0A的sigma（H）驱动的转录不影响Cereulide的合成。AbrB被证明可以有效地与ces操纵子的主要启动子区域结合，这表明AbrB通过对ces转录产生负面影响而充当Cereulide合成的阻遏物。相比之下，CodY作为全局转录调节因子，在Cereulide合成中起关键作用，CodY的缺失导致PlcR的毒力基因下调，同时ces基因上调，CodY被发现是ces操纵子的阻遏子，CodY与免疫抑制剂金属蛋白酶InhA1的启动子结合，将蜡样芽孢杆菌的代谢与毒力联系起来[11]。

不仅内在因素对Cereulide的产生有影响，外在环境因素对Cereulide的产生亦有重大影响[4]。研究发现，蜡样芽孢杆菌生长速率和Cereulide产量是不相关的，这表明仅用细菌数量或生长速率预测Cereulide产生风险是不合适的。MARXEN等[12]用质谱法对Cereulide进行研究，发现Cereulide至少有18种异构体，并且首次发现isocereulides A～G异构体。KRANZLER等[13]研究发现，温度不仅影响Cereulide的总量，还影响Cereulide异构体的形成，并且异构体的毒性显著不同，isocereulide A的毒性比Cereulide高8～10倍，而其他亚型几乎无毒，因此预测Cereulide产生方面应考虑温度的影响。一般来说，在中性pH值、淀粉、碳水化合物、维生素和微量元素含量高的食品中易产生Cereulide，而低氧水平和高NaCl浓度会产生负面影响[2]。

4 结语

蜡样芽孢杆菌呕吐毒素引起的中毒事件日趋增多，呕吐毒素的耐热性和化学稳定性使其难以被消除和破坏。因此，在食品制造过程或储存过程中及时发现Cereulide的存在显得尤为重要。传统微生物法检验蜡样芽孢杆菌检验周期长、效率低，而且不能区分蜡样芽孢杆菌是否产呕吐毒素。以已知非核糖体肽合成酶（NRPS）的高度保守基因序列为靶点的简并寡核苷酸引物用于扩增和鉴定蜡样芽孢杆菌中假定的NRPS基因片段，设计了用于检测产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌的PCR系统[14]和TaqMan探针的实时PCR系统[15]。近年来，质谱技术的进步也显著提高了呕吐毒素的鉴定诊断水平。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱可以基于某些生物标志物直接检测Cereulide，以区分产呕吐毒素和不产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌[16]。研究人员要根据Cereulide的特点开发新方法、新技术，以期快速、准确、高效地检测Cereulide，为食品安全提供保障。