杜炎斌，袁丽英，东 笑，王贵平，3，贾爱卿，3*

(1.广东海大畜牧兽医研究院，广东广州 511400；2.广东省养猪与猪病防控技术研究企业重点实验室，广东广州 511400；3.广东海大集团股份有限公司，广东广州 511400)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪场常见的革兰氏阴性杆菌，HPS在世界范围内分布广泛，包括美国、德国、西班牙、日本等国家均有报道，该病原具有15个血清型，包括部分未确定血清型菌株，其中我国流行的主要血清型为4型、5型和13型[1-4]。HPS可通过直接接触、间接接触及污染物传播。临床中仔猪常见HPS与猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌等混合感染病例，或猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等免疫抑制性疾病后继发。此外，HPS病的暴发可由很多原因引起，常见的有接种疫苗、长途运输、转群、天气骤变、通风不良等均可引其仔猪应激，导致机体免疫力降低，从而引起发病[5]。发病仔猪常出现呼吸困难、咳嗽、关节肿大，剖检多见关节、胸腔、腹腔有纤维素性渗出物，病死率达30%～50%[6-7]。

2020年12月广东省英德市某猪场部分仔猪出现体温升高、呼吸困难、关节肿大等症状，送检部分病料进行病原检测。初步判断其临床症状与副猪嗜血杆菌感染病例较符合。本试验对该规模化猪场发病猪进行病毒抗原检测、病原菌分离，结合PCR鉴定及药敏试验等，为该规模化猪场科学防控副猪嗜血杆菌病提供科学指导，提高经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 英德市某规模化猪场关节肿大并伴有明显呼吸困难的2头37日龄仔猪。

1.1.2 试剂 胰酪胨大豆肉汤培养基、辅酶Ⅰ、新生牛血清、结晶紫草酸盐溶液、碘液、950 mL/L乙醇脱色液、沙黄复染液、灭菌生理盐水、DNA标准 DL 2 000，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司产品；金黄色葡萄球菌，广东海大畜牧兽医研究院有限公司保存。

1.1.3 仪器设备 恒温培养箱，上海笃特科学仪器有限公司产品；C1000PCR仪、电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；Tanon 2500凝胶成像系统，上海天能公司产品，光学显微镜，重庆奥特光学有限公司产品。

1.1.4 引物序列 HPS 16S rRNA引物序列，猪圆环病毒2型(Porcine circo virus type 2，PCV2)引物、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)美洲型、欧洲型通用鉴定引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 检测引物序列

1.2 方法

1.2.1 病猪剖检观察 病死仔猪剖检，剖检过程中记录特征性病理变化，采集病料。

1.2.2 核酸提取及病毒PCR鉴定 按照病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书要求，将仔猪肺脏研磨处理，提取肺脏与血液样品中病毒核酸，部分核酸反转录为cDNA，并设置阴性和阳性对照，进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型PCR鉴定；猪繁殖与呼吸综合征病毒扩增预期目的片段大小为658 bp，猪圆环病毒2型扩增预期目的片段大小为352 bp。

1.2.3 细菌的分离纯化 无菌分别取病猪的肺脏、关节液、心包液于胰蛋白酶大豆琼脂培养基(trypticase soy agar，TSA)平板上进行划线接种。组织表面酒精消毒后，形成创面，灭菌棉签蘸取组织液涂布平板，培养基为含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的TSA培养基，完成后置于恒温培养箱37 ℃培养24 h；观察菌落生长情况，挑取优势菌落进行转接培养；菌落接种于含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的胰酪胨大豆肉汤培养基(trypticase soy broth，TSB)中，37 ℃ 180 r/min培养12 h，菌液进行革兰氏染色，显微镜下观察。

1.2.4 分离菌株卫星试验及生化鉴定 于含50 mL/L血清、不含NAD的TSA平板上，沿竖直方向划线培养金黄色葡萄球菌，另取该分离菌株沿金黄色葡萄球菌划线的垂直方向划线，于37 ℃恒温培养箱培养24 h后，观察是否出现卫星现象。

将分离纯化得到的菌株按说明书要求，分别接种于含NAD的各生化鉴定管中，包括葡萄糖、氧化酶、硝酸还原酶、接触酶、脲酶、果糖、甘露醇和吲哚等生化鉴定管，对分离菌株进行鉴定。

1.2.5 PCR鉴定及测序 按照说明书要求进行细菌核酸提取，使用HPS 16S rRNA基因扩增引物，预期目的条带大小为822 bp。PCR鉴定反应体系为20 μL，包括TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.6 药敏试验 药敏试验采用纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer disc agar diffusion method，K-B法)，选择生产中常用的恩诺沙星、强力霉素、多黏菌素等作为试验药物。取转接培养5 h～6 h的菌液100 μL，使用一次性涂布棒，均匀涂布于含有50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的TSA平板上，再用无菌镊子将各药敏试纸片均匀贴附于TSA平板，轻柔按压，防止药敏纸片脱落，置于37 ℃恒温培养箱培养16 h～24 h，测量并记录各药敏纸片对应抑菌圈大小；参考美国临床和实验室标准协会推荐的判定方法，根据抑菌圈的直径(Φ)大小判定其药物敏感性，对应标准分别为：Φ≥20 mm 为敏感(S)，15 mm≤Φ<20 mm 为中介耐药(I)，Φ<15 mm为耐药(R)。

2 结果

2.1 剖检结果

猪场反馈发病猪群表现为采食减少、咳嗽、呼吸困难，个别猪关节肿大。实验室剖检可见仔猪肺部有大量纤维性渗出物，肺间质充血明显，心包粘连；前后肢关节肉眼可见明显肿大，按压有波动感，剖检可见关节腔内有清亮液体渗出(图1)。

A.体型消瘦，关节肿大；B.关节液渗出；C.肺部病变

2.2 PCV2及PRRSV病原PCR检测结果

PCR电泳结果显示，阴性阳性对照均成立，各样品均未成功扩增到目的条带，该病料PCV2及PRRSV检测均为阴性。

2.3 细菌分离鉴定结果

无菌状态下分离细菌于TSA平板(含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD)，可见针尖大小的透明菌落，呈露珠状；转接菌液经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性杆菌(图2)。

图2 革兰氏染色镜检(1 000×)

2.4 分离菌种卫星试验及生化鉴定结果

观察卫星试验结果，该分离菌株距金黄色葡萄球菌较近时，生长状态较好，菌落较大；距金黄色葡萄球菌较远时，少见有菌落生长(图3)。

图3 卫星现象

分离菌株生化鉴定结果见表2。结果显示该分离株为接触酶、硝酸盐还原酶阳性，能够分解葡萄糖、果糖；氧化酶、甘露醇、脲酶试验均为阴性，吲哚试验、甲基红试验(Methyl red，MR)及VP试验(Voges-Proskauer，VP)试验结果显示为阴性；生化鉴定结果与HPS生化特性一致。

表2 分离菌株生化鉴定结果

2.5 细菌PCR鉴定结果

使用培养的分离株菌液进行HPS 16S引物扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，成功扩增822 bp大小目的片段，条带大小符合预期(图4)；将测序结果进行Blast比对分析，结果显示分离株16S序列与HPS 16S基因同源性达99%以上，确定该分离株为HPS，将本次分离的HPS菌株命名为YD株。

M.DNA 标准DL 2 000;1.YD株

2.6 药敏试验结果

本试验选取临床常用的10种药物对副猪嗜血杆菌YD株进行药敏试验。结果表明，该分离菌株对恩诺沙星、多黏菌素、环丙沙星和强力霉素敏感，对头孢氨苄和大观霉素耐药(表3)。

表3 分离YD株药敏试验结果

3 讨论

随着我国养殖业规模化发展不断加快，细菌性传染病也出现群体性多发趋势。HPS严重危害我国养猪业健康发展，造成巨大的经济损失。规模化猪场多以混合感染病例出现，这给HPS的分离鉴定造成一定困难[8-9]。临床中防控副猪嗜血杆菌病主要通过接种疫苗和使用药物。然而，由于抗菌药物大量使用，有关HPS耐药性的报道逐渐增多[10]。研究表明，菌株对抗菌药物产生耐药性，通常是革兰氏阴性菌中的质粒、转座子或结合子介导的抗性基因(antibiotic resistance gene，ARG)转移的结果，而养猪业长期大量使用抗菌药物则对菌株产生巨大的选择压力，一定程度上加剧了抗性基因在菌株间的水平转移，导致菌株耐药[11-12]。Zhang B等[13]于2012年-2017年从我国16个主要养猪省9 661个养猪场的44 175份样品中分离得到约1 900余株HPS，其药敏试验结果显示，HPS对常见的β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素、四环素、喹诺酮类、多黏菌素和磺胺类药物耐药性呈逐步增加态势。这要求我们在临床中使用药物应更具针对性，选择敏感药物治疗。

考虑该场猪群临床症状、仔猪剖检及病毒检测情况，初步怀疑引起猪场发病病因为细菌感染。对猪场送检病料，进行细菌分离、生化鉴定、药敏试验情况综合分析，最终鉴定为HPS感染。根据猪场需要，公司技术服务人员前往猪场进行现场指导，发现该猪场仍有个别猪存在精神沉郁，关节肿大、卧地不起现象。当时猪价处于高位，该猪场饲养密度较大，通风不良，一定程度亦促进病原滋生，另一方面12月天气寒冷，保育舍内温度较低，这可能成为引起体弱动物副猪嗜血杆菌病暴发的诱因。本研究中，该规模养殖场分离HPS YD株对环丙沙星及恩诺沙星等药物敏感性高，对头孢氨苄、头孢噻吩耐药，提示该规模猪场可使用喹诺酮类药物进行副猪嗜血杆菌病防控。技术人员建议该猪场将发病猪进行隔离治疗，采用100 mg/mL恩诺沙星注射液同时配合使用地塞米松，连用3 d；其余仔猪采用100 g/kg恩诺沙星拌料投喂，药物与饲料添加重量比为1∶1 000，连用5 d。此外，应进行圈舍全面消毒，加强保温，降低养殖密度。后续防控整体建议包括以下三个方面。①饲养管理方面：引种应隔离饲喂1个月后再混群；使用优质的营养丰富的全价饲料，并定期进行水质监测；保证通风，降低饲养密度；建立良好的保温控温设施。②生物安全方面：严格执行全进全出制；定期消毒，特别是当猪群转舍或出栏后应对猪舍进行全面消毒。③疫苗免疫：采用副猪嗜血杆菌灭活疫苗进行免疫接种，并对不同生长阶段猪只制定针对性免疫方案。后续经技术人员回访，该猪场疫病发生情况显著减少，经济效益明显改善。