史玉青，赵尊福 ，阳亭亭，文永平，张焕容

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041)

禽大肠杆菌病是指由禽致病性大肠埃希氏菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的属于几个血清群的任何局限性或全身性感染，并且仍然是影响全球养禽业的最普遍的细菌性疾病之一[1]。APEC可引起多种疾病，包括败血症、腹膜炎和卵黄囊感染等，并且会引起死亡，导致严重的经济损失[2]。长期以来，抗菌药物在细菌性疾病的治疗和预防中取得良好的效果，对养殖业的发展起到了至关重要的作用。但是，由于长期滥用抗菌药物而引起的耐药性问题正呈逐年增长趋势，因此农业农村部提倡了“无抗养殖”。在“无抗养殖”的压力下，为有效控制细菌性疾病的发生和耐药性的产生，寻找抗菌药物替代品成为当前的热点。噬菌体是环境中天然存在的病毒，可常规控制细菌种群[3]。此外，噬菌体对特定细菌的作用，以及自我复制和自限性，使噬菌体成为控制细菌性疾病的替代品[4-5]。而且噬菌体能感染或裂解细菌，被认为是地球上物种最丰富的生物[6-7]。噬菌体在生态系统中分布广泛，不论是海水、沙漠等恶劣的环境中都可找到噬菌体的踪迹。有研究表明，噬菌体生命力之所以如此顽强，与其辅助代谢基因的表达密切相关[8-9]。由于烈性噬菌体能够特异性地裂解相应宿主菌，被认为可替代抗菌药物用于治疗细菌性疾病。噬菌体除了用于治疗细菌性疾病，还可用于生物技术、生物传感器、食品保鲜、污染修复和废水处理等领域[10]。出于安全原因，如果允许噬菌体是抗菌药物的替代方法，则需要清楚其基因组信息。本研究对从某养鸡场污水中分离鉴定出的1株烈性大肠埃希氏菌噬菌体Bp38进行生物信息学分析，为进一步利用该噬菌体提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大肠埃希氏菌和噬菌体的来源 O2血清型禽致病性大肠埃希氏菌，由西南民族大学动物医学实验室从某养鸡场病死鸡实质器官分离鉴定并保存；噬菌体Bp38，以该血清型禽致病性大肠埃希氏菌为宿主菌，从鸡场的污水中分离获得。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；酵母提取物，上海蓝季科技发展有限公司产品；NaCl，天津市致远化学试剂有限公司产品；琼脂粉，天津市科密欧化学试剂开发中心产品；SM缓冲液，上海信帆生物科技有限公司产品；聚乙二醇PEG8000，上海雷布斯科技有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 电热恒温水浴锅(HWS-24 26 28 12)，上海一恒科学仪器有限公司产品；恒温培养箱(DHP-9162)，上海和呈仪器制造有限公司产品；超净工作台(SW-CJ-1C)，浙江孚夏医疗科技有限公司产品；高速冷冻离心机(Sorvall Stratos)，赛默飞世尔科技有限公司产品；恒温摇床(SPH-110X24台式)，上海世平实验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体基因组的提取及测序 噬菌体Bp38接种O2血清型禽致病性大肠埃希氏菌后富集浓缩，噬菌体浓缩液用TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取噬菌体的基因组，基因组含量不少于2 μg。委托赛默百合生物科技有限公司对提取的噬菌体基因组进行全基因组测序，并对噬菌体基因组进行拼接，得到完整的基因组序列。

1.2.2 噬菌体Bp38基因组基本特性分析 通过DNA Star软件中的EdiSeq对测得的基因组序列进行一般特性分析，包括基因组长度、4种碱基的组成情况及GC含 量；利用tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)查找基因组序列中的tRNA编码基因，利用tRNAdb(http://rna.tbi.univie.Ac.at/forna/)在线工具对tRNA的二级结构进行可视化[11]。

1.2.3 噬菌体Bp38的ORF预测及功能注释 通过NCBI中ORF finder在线工具进行全基因组的基因预测，将预测到的开放阅读框翻译成氨基酸序列，用Smart Blast将氨基酸序列与已知功能的蛋白进行比对，完成功能注释，用SnapGene软件对全基因组进行可视化分析，认识该物种的功能基因[12]。

1.2.4 噬菌体Bp38的遗传进化分析 选择噬菌体全基因组序列保守区域的末端酶大亚基基因序列在NCBI中进行比对，用MEGA7.0软件将同源性在前10位的序列构建进化树，该进化树通过邻接法(Neighbor-Joining)构建，复常检验(Bootstrap)次数设为500次，分析并找出与噬菌体Bp38同源关系最近的噬菌体[13]。

1.2.5 Bp38溶菌酶基因的选择压力分析 将溶菌酶基因在NCBI进行比对，选取同源性较高的序列，利用MEGA7.0软件进行多重序列比对并删除终止密码子，采用在线软件Datamonkey (http://www.datamonkey.org)中的SLAC法，检测选择位点，根据设定P<0.1认为差异有统计学意义，当dN/dS>1且P<0.1为正向选择，dN/dS<1且P<0.1时为负向选择[14]。

2 结果

2.1 噬菌体Bp38基因组基本特性

噬菌体Bp38基因组序列全长170 004 bp；碱基分布为 A(30.55%)、T(31.85%)、G(18.14%)、C(19.46%)，平均GC含量为37.60%，核酸类型为双链DNA(dsDNA)。Blastn结果显示，该噬菌体为有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、Tevenvirinae属的噬菌体成员。用tRNAscan-SE软件预测tRNA，发现噬菌体基因组上有2个tRNA编码序列，分别位于163 998 bp～163 925 bp和164 078 bp～164 005 bp(表1)；第1个tRNA反密码子为TCT，转运精氨酸(Arg)，第2个tRNA反密码子为CAT，转运蛋氨酸(Met)，二级结构如图1。

表1 噬菌体基因组预测的tRNA

2.2 预测的噬菌体Bp38 ORF及其功能

将噬菌体Bp38基因组预测的ORF在NCBI中进行比对，预测ORF的起始位置、具体长度和预测的功能，共预测出140个ORF，最长的ORF编码1 277 aa，最短的ORF编码83 aa。

根据预测的功能可将其分为5个模块：裂解模块、DNA包装模块、结构组成模块、假性蛋白模块和核酸复制与调控模块。从可视化基因组图谱中了解到，DNA包装模块包括 terminase large subunit和protease inhibitor；噬菌体结构组成模块包括tail protein、neck protein、portal vertex protein、prohead core protein、major capsid protein、baseplate hub subunit、tail fibers protein、tail fiber attachment catalyst和sliding clamp等；核酸代谢与复制模块包括DNA helicase、DNA ligase、putative polynucleotide kinase、thymidylate synthase、putative dihydrofolate reductase、RnaseH、DNA endonuclease IV、exonuclease、dCTP pyrophosphatase、NTP_transferase domain-containing protein、DNA polymerase、thymidine kinase、nudix hydrolase deoxynucleoside monophosphate kinase等；与噬菌体裂解功能相关的基因有tail lysozyme、T holin lysis mediator、lysozyme等，有56个假性蛋白未知其功能，需要进一步研究。

A.编号1;B.编号2

2.3 噬菌体Bp38的进化关系

系统发育进化树能更好地分gc析噬菌体Bp38与其他噬菌体的关系，选取在氨基酸水平上保守性结构区域末端酶大亚基(terminase large subnit)基因序列，和其他同源性较高噬菌体的末端酶大亚基核酸序列构建系统发育进化树。结果如图2所示，噬菌体Bp38与Escheerichiaphage ST0和Escheerichiaphage vB EcoM G2285亲缘关系最近，在同一分支上；与Escheerichiaphage F2、Escheerichiaphage p000v、Escheerichiaphage mogra和Escheerichiaphage SF的亲缘关系相对较远。因此可以确定噬菌体 Bp38为有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、Tevenvirinae亚科、Mosigvirus属。

图2 噬菌体Bp38进化树

2.4 Bp38溶菌酶基因的选择压力

利用MEGA7.0选取53条同源性较高的序列进行比对并删除终止密码子，Bp38溶菌酶基因的序列经Datamonkey检测分析可知，共有173个氨基酸位点，有2个正向选择位点，位于氨基酸序列的第34和第126的位置；有10个负向选择位点，分别位于氨基酸序列42、53、59、68、98、102、103、106、122和132的位置(表2)。

表2 溶菌酶的氨基酸位点选择压力分析结果

3 讨论

噬菌体Bp38基因组序列全长170 004 bp，平均GC含量为37.60%，核酸类型为双链DNA(dsDNA)。随着分子生物学和测序技术的发展，噬菌体的基因组序列不断被公布[15]。噬菌体基因组越大，其利用宿主资源的能力越强，到目前为止，公布的噬菌体全基因组序列为33 000条左右，大肠埃希氏菌噬菌体为833条，其基因组大小在3.4 kb～316 kb之间[16-18]。

噬菌体Bp38基因组中有2个tRNA编码序列，分别转运精氨酸(Arg)和蛋氨酸(Met)。噬菌体基因组的大小与其包含的tRNA基因数量之间存在正相关性，表明噬菌体tRNA基因可能在宿主菌翻译蛋白质中发挥一定作用，也可能是宿主菌经多次复制翻译后保留下来的[19]。目前，仅在双链DNA噬菌体的基因组中发现了tRNA。噬菌体不但能利用宿主菌的大多数翻译机制，也能用自己的遗传信息对翻译机制进行补充，以更好地适应生存环境。有研究表明tRNA的分布与密码子利用情况存在显著关系[20]。噬菌体基因组中的tRNA能弥补宿主菌中缺少的tRNA，这使得噬菌体可以提高翻译蛋白质的效率[21]。还有研究表明，裂解性噬菌体比温和性噬菌体含有更多的tRNA，可能与裂解性噬菌体繁殖速度有关，因为其需要高效率地翻译mRNA，同时也说明tRNA越多裂解性越强[22]。

噬菌体Bp38基因组共预测出140个ORF，根据预测的功能可将其分为裂解模块、DNA包装模块、结构组成模块、假性蛋白模块和核酸复制与调控模块。DNA包装模块中的末端酶与基因组形成核酸-蛋白复合物，并与衣壳蛋白相互作用组成包装机器，驱动基因组DNA进入前衣壳[23]。噬菌体的结构蛋白组成了噬菌体的头部、颈部和尾部，尾部纤维蛋白有助于噬菌体吸附宿主菌，尾部附着催化剂还能在细胞壁上形成空洞，把遗传物质注入宿主细胞内[24]。预测出5个与裂解功能相关的基因，其中穿孔素可在细胞膜形成跨膜通道，溶菌酶可破坏细胞壁，裂解基因的表达产物在噬菌体感染宿主菌和子代噬菌体从宿主菌中释放发挥重要的作用[25]。另外，有56个假性蛋白未知其功能，还需要进一步研究。

以末端酶大亚基的基因序列构建系统发育进化树的结果表明，噬菌体 Bp38为有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、Tevenvirinae亚科、Mosigvirus属。末端酶大亚基在氨基酸水平上是保守性结构区域，通过其基因序列构建系统发育进化树，能更好地分析噬菌体Bp38与其他噬菌体的关系。末端酶是一类寡聚体多功能蛋白，在噬菌体DNA包装过程中发挥重要作用，大亚基可特异性结合病毒衣壳顶角处的孔蛋白、金属离子及ATP，具有ATP酶、核酸内切酶和DNA解旋酶活性[26-27]。

选择压力是指外界施与生物体进化过程的压力，从而改变该过程的前进方向，使其适应自然环境得以存活和繁衍[28]。基因选择压力可用非同义替换率 (dN) 和同义替换率 (dS) 的比值来判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因，如果dN/dS>1，则认为有正选择效应；dN/dS=1，则认为存在中性选择；dN/dS<1，则认为有纯化选择作用[29]。本研究中，噬菌体Bp38溶菌酶基因序列有173个氨基酸位点，有2个正向选择位点，有10个负向选择位点，溶菌酶基因经历外界环境选择压力和自身进化压力双重影响，且自身进化压力强于外界环境选择压力。综上所述，本研究阐明了大肠埃希氏菌噬菌体Bp38的分子特征，为进一步利用该噬菌体提供了理论依据。