杨振兴，李卓然，何于雯，李占鸿，李 乐，廖德芳，杨 恒，朱建波

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224)

Committee for the Taxonomy of Viruses,ICTV)第8次会议确认的一种新病毒属[1]。病毒粒子直径在65 nm～75 nm之间，为20面体或球形，表面具有明显刺状突起，基因组大小约为20 kb～21 kb，由(Seg-1～Seg-12)12个基因节段的dsRNA组成(3.8 kb～0.8 kb)，可编码VP1～VP12共12种蛋白[2]。

BAV为东南亚十二节段RNA病毒属的代表毒株，于1987年首次从我国西双版纳地区无名热和脑炎患者采集的脑脊液及血清样本中分离出[3]。此后又陆续从老挝、越南、印度尼西亚等东南亚国家和中国甘肃、山西、内蒙古、湖北等地采集的蚊虫或库蠓样品中分离出[4]。并且多次直接从不明热和病毒性脑炎患者的体液中分离到BAV和筛查到相应的IgM和IgG抗体，这些研究结果表明了BAV可能是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病病原，引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的广泛关注[5-6]。MSV为一种新发现的虫媒病毒，于2013年在云南省芒市采集的三带喙库蚊(C.tritaeniorhynchus)中首次分离并因而得名[7]，2014年在我国广东省汕头市濠江区采集的三带喙库蚊中再次分离到MSV，并于2019年首次从云南省景洪市哨兵牛的血液中分离到了MSV[8-9]。但作为新发虫媒病毒的MSV，感染宿主动物的范围、感染特征、对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚。

近年来，寨卡病毒[10]、登革病毒[11]、非洲猪瘟病毒[12]、非洲马瘟病毒[13]等新发和再发虫媒病毒给我国的公共卫生和畜牧业的安全生产带来了严重威胁。云南省地处我国西南边陲，特有的气候条件适合多种虫媒病毒在人和动物之间循环传播，BAV和MSV均首次在云南分离，提示该地区为新发虫媒病毒病的高风险地区[14]。因此，建立2种病毒的检测方法，在云南省开展相关流行病学调查，对保障我国养殖业的安全生产和公共卫生安全具有重要的意义。

目前本实验室已建立了BAV和MSV的常规RT-PCR检测方法[5,9]，虽然均具有准确可靠的优势，但常规RT-PCR耗时长，灵敏度低，扩增结束后需电泳检测，易污染，很难在感染初期检出病毒。环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的一种新型恒温核酸扩增方法[15]，该方法借助具有链置换作用的BstDNA聚合酶帮助，可在等温条件下进行靶序列高效快速扩增，避免了RT-PCR的梯度升降温模式[16]。LAMP无需昂贵的仪器设备，可以根据反应管中液体颜色的变化，通过肉眼识别即可做出判断，做到了真正意义上的现场可视化快速检测[17]。近年来，国内外已将该技术广泛应用于细菌、真菌和病毒等病原微生物的检测，其灵敏度、特异性和时效性都有很好的体验。但目前尚未见该方法用于BAV和MSV检测中，本研究选择我国分离的BAV(YNSC043)[5]和MSV(V301/YNJH/2019)[9]毒株的Seg-12序列作为靶基因，根据高保守区域设计特异性引物，建立RT-LAMP检测方法，为开展我国BAV和MSV的检测与流行病学调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、昆虫样品 流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)YNSZ/V003/2012[18]、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)GDST008[19]、中山病病毒(Chuzan virus，CHUV)SZ187[20]、广西环状病毒(Guangxi orbivirus，GXOV)V172/GX/2015[21]、阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)V287/YNSZ/2019[22]、西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)YNSZ/V290/2019[23]、BAV(YNSZ043)[5]和MSV(V301/YNJH/2019)[9]等虫媒病毒由本实验室分离保存。昆虫样品为采集自云南省景洪和师宗不同地区牛、羊养殖场的2 596只蠓虫和蚊虫。

1.1.2 主要试剂 WarmStart○RLAMP变色预混液(M1800)，新英格兰生物实验(北京)公司产品；一步法RT-PCR试剂盒、DNA Marker DL 5 000和DH5α感受态细胞，TaKaRa公司产品；pLB零背景快速克隆试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；磁珠法病毒核酸提取试剂盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 恒温金属浴(Scientific)、PCR仪(ABI9700)和核酸提取仪(AutoMate Express)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；凝胶成像系统(dXRS)，美国伯乐公司产品；紫外分光光度(UV5Nano)计，梅特勒-托利多(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和合成 从GenBanK中下载BAV和MSV株的Seg-12基因序列，与本研究室前期分离毒株的Seg-12序列进行比对，选择高度保守区域，利用Primer Exporer V5(http://primerexplorer.jp/e/)在线软件设计5条特异性引物，包括1对外引物F3/B3，1对内引物FIP/ BIP和1条环引物Floop(表1)。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

表1 BAV和MSV的RT-LAMP检测引物

1.2.2 核酸的提取及质粒标准品构建 使用磁珠法病毒RNA提取试剂盒，按照产品说明书方法对EHDV、BTV、CHUV、GXOV、AKAV、TIBOV、BAV和MAV毒株及昆虫样品进行RNA提取。标记编号后，PCR仪上95 ℃加热5 min后迅速冰浴冷却进行变性处理，置-70 ℃保存备用。分别利用BAV和MSV RT-LAMP的外侧引物F3/B3对提取的BAV和MSV核酸进行RT-PCR扩增，将胶回收产物与pLB载体连接，转化感受态细胞后，筛选、鉴定正确重组质粒，并进行测序验证。经紫外分光光度计测定质粒核酸浓度后，根据公式计算出核酸拷贝数。

1.2.3 可视化RT-LAMP反应体系及反应条件的优化 分别以BAV和MSV核酸为模板，参照试剂盒推荐的反应体系(25 μL)：WarmStart LAMP 2× Master Mix 12.5 μL，F3/ B3引物(10 μmol/L)各1 μL，FIP/ BIP 引物(20 μmol/L)各1 μL，Floop(20 μmol/L)1 μL，模板核酸2 μL，加入无核酸酶灭菌水至25 μL；在此反应体系和反应条件下，利用棋盘法分别优化内外引物比例(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、反应温度(60、62、64、66 ℃)，反应时间(40、50、60 min)，核酸模板(1、1.5、2 μL)确定每种病毒检测的最佳反应体系和条件。

1.2.4 特异性试验 取EHDV、BTV、CHUV、GXOV、TIBOV、BAV和MSV等虫媒病毒的核酸为模板，以ddH2O为阴性对照，分别用建立的BAV和MSV RT-LAMP方法同时进行检测，分析2种方法的特异性。

1.2.5 敏感性试验 分别将已经测定核酸拷贝数的BAV和MSV重组质粒用无核酸酶灭菌水10倍梯度稀释成100～106拷贝/μL的7个浓度梯度，每个反应管加入1 μL稀释的质粒样品作为模板，分别进行BAV及MSV的RT-LAMP和常规RT-PCR[5,9]检测，反应结束后进行凝胶电泳，分析比较2种方法的敏感性。

1.2.6 昆虫样品检查 分别用BAV和MSV的RT-LAMP及常规RT-PCR方法[5,9]同时检测2 596份蠓虫和蚊虫的核酸样品，反应结束后进行凝胶电泳，比较2种方法的检出率，并计算二者的符合率。

2 结果

2.1 质粒标准品的构建

经紫外分光光度计测定构建的BAV和MSV基因重组质粒pLB-BAV/043/Seg-12和pLB-MSV/V301/Seg-12的核酸浓度分别为29.2 ng/μL和41.8 ng/μL，根据公式计算出核酸拷贝数分别为1.37×1011拷贝/μL和1.9×1011拷贝/μL。

2.2 可视化RT-LAMP反应体系及反应条件的优化

经棋盘法确定2种病毒优化后的RT-LAMP反应体系(25 μL)：Warm Start LAMP 2× Master Mix 12.5 μL，F3/PB3引物(10 μmol/L)各0.2 μL，FIP/BIP 引物(20 μmol/L)各0.4 μL，Floop(20 μmol/L)0.4 μL，模板核酸1.5 μL，加入无核酸酶灭菌水至25 μL；反应条件为64 ℃ 50 min，80 ℃ 5 min终止反应。RT-LAMP反应结束后，核酸样品反应液颜色由粉红色变为黄绿色，电泳呈现梯度状条带，为阳性；而阴性对照的反应液仍为粉红色，电泳无条带出现，为阴性(图1)，表明优化所得BAV和MSV RT-LAMP可视化反应结果良好。

M.DNA 标准DL 5 000;1.阴性对照；2.芒市病毒；3.阴性对照；4.版纳病毒

2.3 特异性试验

用建立的BAV和MSV RT-LAMP分别对TIBOV、EHDV、BTV、CHUV、GXOV、BAV和MSV的核酸进行检测，结果显示仅有BAV(图2)和MSV(图3)核酸检测结果出现梯度状条带，反应管颜色变为黄绿色，显现为阳性，而其他病毒的检测结果均为阴性，同时，两种病毒的检测方法间也无交叉反应，表明建立的BAV和MAV RT-LAMP均具有较强的特异性。

M.DNA 标准DL 5 000;1.蓝舌病病毒；2.流行性出血病病毒；3.阿卡斑病毒；4.广西环状病毒；5.中山病病毒；6.芒市病毒；7.版纳病毒；8.西藏环状病毒

M.DNA 标准DL 5 000;1.蓝舌病病毒；2.流行性出血病病毒；3.阿卡斑病毒；4.广西环状病毒；5.中山病病毒；6.芒市病毒；7.版纳病毒；8.西藏环状病毒

2.4 敏感性试验

分别用无核酸酶灭菌水10倍梯度稀释BAV和MSV基因重组质粒成1.37×100～1.37×106拷贝/μL和1.9×100～1.9×106拷贝/μL的7个浓度梯度，各取1 μL为模板同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测。结果显示RT-PCR(图4A和图5A)分别检出BAV和MSV的最低核酸拷贝数分别为137拷贝/μL和190 拷贝/μL，RT-LAMP(图4B和图5B)分别检出BAV和MSV的最低核酸拷贝数分别为13.7拷贝/μL和19.0拷贝/μL，但RT-PCR的电泳条带较弱，表明RT-LAMP较RT-PCR灵敏至少高10倍以上。

A.常规RT-PCR；B.RT-LAMP；M.DNA 标准DL 5 000;N.阴性对照；0～6.阳性质粒10倍倍比稀释至100 拷贝/μL～106 拷贝/μL的7个梯度样品

A.常规RT-PCR；B.RT-LAMP；M.DNA 标准DL 5 000;N.阴性对照；0～6.阳性质粒10倍倍比稀释至100 拷贝/μL～106 拷贝/μL的7个梯度样品

2.5 昆虫样品的检查

分别用BAV和MSV的RT-LAMP和常规RT-PCR同时检查2 596份蠓虫和蚊虫的核酸样品。BAV结果显示(表2)，RT-LAMP检测77份为阳性，检出率为2.97%；RT-PCR检测29份为阳性，检出率为1.12%；2种方法检测同为阳性和阴性的样品各为29份和2 519份，符合率为[(29+2 519)/2 596]×100%=98.15%。MSV结果显示(表3)，RT-LAMP检测61份为阳性，检出率为2.35%；RT-PCR检测25份为阳性，检出率为0.96%；2种方法检测同为阳性和阴性的样品各为25份和2 535份，符合率为[(25+2 535)/2 596]×100%=98.61%。以上结果表明RT-PCR虽能用于检测昆虫样品中的病毒核酸，但因敏感性较RT-LAMP低，导致部分病毒载量较低的阳性样品检查结果为阴性。

表2 BAV RT-LAMP和RT-PCR检测结果

表3 MSV RT-LAMP和RT-PCR检测结果

3 讨论

近年来随着人们对东南亚十二节段RNA病毒属病毒的深入研究，不断有新型病毒被陆续分离和发现[1]，这一方面拓展了人们对该病毒属病毒的认识，另一方面掌握其新发病毒的流行特征在动物疫病防控与保障公共卫生安全中的重要意义。东南亚十二节段RNA病毒属病毒的基因节段Seg-12，编码病毒基因组RNA结合蛋白VP12，该基因节段在东南亚十二节段RNA病毒属的同种病毒间高度保守，而在不同种病毒间变异度较大，是用于鉴定病毒的理想靶基因[24-25]。因此本研究根据BAV和MSV基因节段Seg-12的保守区设计特异性引物，建立了RT-LAMP检测技术，完善了2种病毒的检测技术体系。

本研究针对BAV和MSV的靶片段分别设计了5条特异性引物，提高了扩增效率，增加了扩增产物，相对降低了钙黄素的抑制率。同时，使用含钙黄素的预混染料，在反应结束后，就可以直接观察对比颜色变化，判断待测样品的阴性或阳性。阳性样品管会出现明亮的黄绿色，而阴性样品管为粉红色，通过与阴性对照比较，在自然光下肉眼识别就可以做出判定。这样就避免了采用电泳等开管方式检测时，容易使扩增产物气溶胶溢出，污染实验环境从而出现假阳性的可能。由于RT-LAMP比RT-PCR的扩增效率高，开管检测的方式更容易引起实验的污染，这是RT-LAMP技术在基层推广中遇到的最大问题[26]。

TIBOV、EHDV、BTV、CHUV和GXOV均为蠓虫或蚊虫传播的虫媒病毒，自然环境中多种虫媒病毒流行区域重叠或同时感染易感动物的现象较普遍[27]。因此，为确保RT-LAMP检测方法的特异性，我们将以上5种病毒的核酸同时进行检测，结果均为阴性，表明本研究建立的RT-LAMP检测方法具有较好的特异性。同时通过引入1条环引物，摸索最佳扩增温度，提高了RT-LAMP的反应效率，进一步缩短反应时长，加速显色反应，分别以BAV和MSV质粒为检测对象，其最低检出限分别为13.7拷贝/μL和19.0拷贝/μL，反应时间仅为RT-PCR的一半，敏感性是RT-PCR方法的10倍以上。

昆虫样品检测结果显示，因为RT-LAMP的灵敏度更高，而阳性昆虫样品的病毒载量较低，所以导致RT-LAMP对2种病毒的检出率均是常规RT-PCR方法的2倍以上。同时发现RT-PCR检测昆虫样品时，扩增产物的电泳条带较弱，可能导致一些样品检测时出现假阴性。因此,RT-LAMP有更好的灵敏度和时效性，更适合大规模样品的快速检测和病原学调查，所以本研究建立的RT-LAMP为我国开展BAV和MSV的流行病学调查和疫病的现场快速检测提供了一种有效的技术手段。