田 晨，王 冉，段永波

(淮北师范大学 a.生命科学学院，b.安徽省特色资源植物利用工程实验室，安徽 淮北 235000)

中草药植物资源维持着全球超过80%的人口尤其是发展中国家人民的身体健康[1]。然而，野生资源难以满足市场需求，且当前仅有0.94%的药用植物以大田栽培为主[2]。天然条件下，很多药用植物不选择有性生殖途径，这使后代能较好地获得母体的遗传性状，特别是活性成分的稳定[3]。病毒病已成为营养繁殖类药用植物生产的主要限制因素之一[4]，使用无病毒繁殖材料是这类植物生产的重要保障。

植物病毒是非细胞形态的生命体，以全寄生方式生存于寄主植物，有“植物癌症”之称[5]。自从在马铃薯和草莓等作物中成功应用以来，脱毒培养已广泛应用于药用植物研究[6]。然而，关于药用植物脱毒培养的研究大部分都局限于实验室阶段，真正大规模应用的极少[7]。相比于生殖生长的植物来讲，病毒病对营养繁殖类药用植物的危害更为严重[8]，但目前此类植物感染病毒及脱毒研究的现状尚不清楚。

文献计量分析可很好地反映相关领域研究概况，提供有确切数字的有力背景资料[9]，为后续研究提供参考。本文以相关文献为研究对象，统计分析了发文量、病毒感染种类、脱毒方法及病毒检测技术等指标，并就相关研究热点及研究前景进行了展望，以期为加速该类植物脱毒材料规模化应用提供思路。

1 研究资料与方法

1.1 研究资料

本文选取市场用量极大的30种营养繁殖类(或能生殖生长但以营养繁殖为主)药用植物的文献为研究对象。植物种类如下：百合、半夏、薄荷、贝母、大蒜、大枣、丹参、地黄、枸杞、红花、菊花、葡萄、月季、桃、灵芝、龙眼、芦荟、罗汉果、马钱子、麦冬、枇杷、人参、山药、山楂、生姜、石斛、太子参、唐菖蒲、玄参和桑。

1.2 方法

1.2.1 文献调研

在中国知网(CNKI)(http://www.cnki.net/)输入关键词“某植物+病毒/脱毒”，在Web of Science(WOS)(http://www.webofscience.com/)输入“plant name + virus/virus elimination ”搜索1987—2020年的相关文献，浏览各篇文献摘要，剔除综述和新闻报道类，建立相关数据库。

1.2.2 归纳分析法

根据所建立的数据库，统计不同年份中文和英文文献发文量、病毒种类及研究内容。对脱毒方法、病毒检测方法和脱毒效果进行归纳总结，进而分析我国营养繁殖类药用植物病毒检测及脱毒复壮研究现状。

2 结果与分析

2.1 发文量

共检索到有关文献222篇，其中CNKI数据库文献202篇，WOS 20篇。在CNKI文献中，对百合[10]、大蒜[11]、菊花[12]和生姜[13]的脱毒研究较多，而有关桑、玄参、银杏等植物的研究较少。WOS文献关于百合、大蒜、菊花这3种植物的研究较多，少数涉及山药和桃等。

从图1可以看出，1987—2009年的发文量总体呈逐渐上升趋势。2002年前发文量较少，2002—2009年，中文文献快速增加，这些文献大多聚焦在既属药用又具其他价值的植物，表明这期间的脱毒研究可能更关注其食用和观赏等方面价值。之后CNKI发文量呈现下降趋势，WOS发文量有小幅度增加。分析原因，可能因部分药用兼具其他功能植物的脱毒技术逐渐发展成熟，而对仅有药用功能植物的关注有所减少[14]，也可能与研究水平逐渐提高将研究成果发表于英文杂志有关。

2.2 病毒种类及研究内容分类

按植物种类将相关文献分类，统计各自文献总数及病毒种类(表1)。其中百合、大蒜、生姜、菊花文献数较多，分别为33、43、30和23篇，而大枣、红花、灵芝、芦荟等植物文献较少，各仅有1篇。药用植物感染的病毒包括黄瓜花叶病毒(CMV)、大蒜潜隐病毒(简称GLV)、烟草花叶病毒(TMV)、韭葱黄条病毒(LYSV)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯M病毒(PVM)等。按照研究内容统计，关于脱毒方法的文献最多，除枸杞、麦冬、玄参之外的其他植物均涉及到脱毒方法，其次是病毒检测技术研究，还有部分涉及脱毒材料的田间试验。百合、大蒜等植物的研究文献虽然较多，但主要集中在脱毒方法优化方面，关于病毒检测技术和田间试验的文献均低于10%，而灵芝、大枣等重要药用植物还未有病毒检测技术和田间试验方面的研究。麦冬和玄参的文献虽然只有1～2篇，但都是报道其田间试验，这也从侧面反映了生产上对于脱毒材料的迫切需求。

2.3 脱毒方法分析

脱毒方法主要包括茎尖培养脱毒、热处理结合茎尖培养脱毒、病毒唑结合茎尖培养脱毒、化学法、微生物法(表2)。涉及茎尖培养的脱毒文献研究占总文献的87%。茎尖为植物幼嫩器官，未受到病毒感染，能快速实现植株脱毒[15]，是研究的首选外植体。由于部分病毒难以脱除及植物同时感染多种病毒等问题，基于茎尖培养又发展出了热处理结合茎尖培养脱毒[16]、茎尖培养结合病毒唑脱毒[17]等与其他理化手段结合等综合处理法，进而达到脱毒的目的。

此外，部分植物脱毒研究中还使用了微生物法脱毒、化学法脱毒[18]、物理法脱毒[19]、基因编辑技术[5]或者超低温脱毒技术[20]等。这些技术为上述常用手段的重要补充，也是未来脱毒方法研究的新方向，有助于保持本品种的遗传特性，提高繁殖系数，保证营养繁殖类药用植物的安全生产。

表1 感染病毒种类及研究主题分类占比

表2 脱毒方法的使用情况

表3 病毒检测方法的使用情况

2.4 病毒检测方法分析

常用的营养繁殖类药用植物病毒检测方法包括电镜、RT-PCR、酶联免疫吸附(ELISA)和指示植物法。其中，ELISA使用频率最高，达到45.04%，其后依次为RT-PCR法、电镜检测法和指示植物法(表3)。ELISA法是抗原和抗体免疫反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术，灵敏度高，测定速度快，且能同时测定多个样品。当前基于ELISA法的病毒检测以试纸为载体，操作简单易行，因此成为最主要的检测方法。部分研究还使用了双链RNA电泳技术、血清学方法以及环介导等温扩增技术等，为病毒脱毒效果的检测提供更为准确的数据。

表4 危害植物较严重的病毒种类情况

表5 脱毒效果情况分析

2.5 植物病毒分布情况

由表4可知，危害植物较严重的病毒有黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、百合无症病毒(LSV)以及番茄不孕病毒(TAV)等。其中研究感染CMV的文献有65篇，占总文献数的32.2%，分布植物种类有11种，包括百合、半夏、薄荷、贝母、丹参、地黄、枸杞、菊花、红花、山药、罗汉果。涉及TMV的文献44篇，分布于贝母、菊花、大蒜、半夏、地黄等5种植物。涉及PVY的药用植物所占文献较少，仅有8篇，分布药用植物种类包括菊花、山药、枸杞等3种。CMV、TMV和PVY等病毒侵染植物后能造成花叶、皱缩、条纹等肉眼可见表型，因此受到更多关注，而对于LSV等感染后表型不太明显的病毒研究则较少。

2.6 脱毒效果分析

如表5所示，百合、生姜、大蒜、地黄和菊花涉及文献中报道脱毒效果的文献数都大于6篇，而贝母、红花、桃和桑的研究文献相对较少，都只有1～2篇。研究文献较多的植物感染病毒情况也更为复杂，如大蒜感染病毒种类达到19种，脱毒效果在85%～100%。而贝母、红花等植物脱毒效果彻底，均达到了100%，与这些植物感染病毒种类较少，也可能与部分植物能进行生殖生长而减轻病毒感染有关。另外，有的文献虽然没有记载具体的脱毒成功率，但用于高产栽培技术研究，也间接证实了较好的脱毒效果。

3 讨 论

3.1 关于药用兼具其他功效的植物研究较多，而单一药用价值的植物较少

百合、生姜、大蒜和菊花这4种植物的脱毒文献较多，其中大蒜的文献最多，共43篇，占19.37%。大蒜受气候、种植等方面的限制，会加重病毒的感染[21]。大蒜的脱毒研究极多，可能更主要是由于其食用价值需求，推动脱毒材料应用于田间生产[22]。从两大数据库共检索到百合脱毒培养的文献33篇，占14.86%。百合不仅药用价值高，还是重要的花卉，具有较高的观赏价值[23]。生姜文献共30篇，占13.51%，生姜可作为药、食、加工等经济作物，是我国重要的外贸产品[12]。菊花具有药用、食用及观赏价值，检索到文献共23篇。然而，地黄、丹参等脱毒研究主要集中在实验室[24]，仅少量应用于田间。地黄是单一药用的多年生草本植物，尽管为大宗常用中药材[25]，但相关文献较少，占比仅为1%～6%，且研究方法较为单一。此外，如唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参[26]，具很高的药用价值，以人工栽培为主，亟待加速脱毒材料的田间使用。

大田作物草莓和马铃薯的脱毒技术发展已较为成熟，采用茎尖脱毒和热处理加茎尖脱毒使得田间规模化生产中无病毒苗比率达到80%～95%[27]。而药用植物中的营养繁殖类植物的研究则极为滞后，需加快研究进程，促进脱毒材料的田间推广。

3.2 文献研究涉及最多的是脱毒方法，但病毒检测方法正成为研究热点

发表的文献对脱毒方法的研究颇多[28]，但大部分以传统方法为主，耗时久，脱毒效果不明显，而且少数病毒并不能彻底脱除。目前使用最多的脱毒方法是茎尖脱毒培养法[29]，综合使用频率为45.65%，但该方法对于某些病毒的脱毒效果不理想。采用多种脱毒方法相结合可获得更好的脱毒效果[30]。脱毒技术提高了药用植物的产量和品质[31]，但还存在很多瓶颈和问题。采用多种脱毒方式结合可利用各自优点，更好地脱除“顽固”病毒[32]，将是药用植物脱毒研究的重要方向。

病毒检测方法中，ELISA检测方法使用频率最高，为45.04%。此方法敏感性好，特异性高[33]，但需要特异性抗体，且在检测多种病毒时灵敏度降低，出现“假阳性”[34]，可能干扰田间规模化生产脱毒苗的脱毒质量。分子生物学技术可精准地对病毒感染情况作出检测[35]，但需进行基因组DNA提取和PCR扩增等，程序较为复杂。因此，发展简单易行的DNA提取方法及高通量PCR扩增技术对于加快药用植物脱毒效果的分子检测意义重大。

3.3 药用植物脱毒的分子机制还待进一步深入

植物病毒病害是危害农业的第二大病害，但脱毒方法均难以实现脱毒的精准控制。对于茎尖培养法，由于茎尖很小，实际操作中有一定的误差，因此该种方法常常和其他脱毒方式相结合[36]。热处理法中，病毒比植物耐热能力差，但只能杀死部分病毒，并且对于脱毒植物本身的耐受温度要求比较高[37]。在病毒唑结合茎尖培养法中，茎尖长度对植物茎尖脱毒率的影响最大，而病毒唑质量浓度则影响茎尖成活率[38]。化学法脱毒易于分化出苗，提高存活率，但化学试剂可能会对环境造成危害。超低温脱毒成功案例少，超低温处理引起的表观遗传现象等尚需进一步研究[39]。花药培养脱毒法降低了脱毒苗生产成本，但与茎尖分生组织培养相比，培养周期长，不利于快速繁殖。当前使用的脱毒方法各有优缺点，其根本原因在于未能掌握植物病毒脱除的分子机制。新近研究揭示了干细胞重要调控基因WUS在免疫病毒中的关键作用[40]，揭示了植物茎顶端分生组织存在广谱抗病毒免疫的分子机制，为精准高效地实现营养繁殖药用植物的脱毒提供了新思路。