崔丽伟， 贾馨雅， 刘俊桃， 胡 平， 徐 军， 陈威风*

(河南牧业经济学院，河南郑州 450046)

敌草隆是兼具内吸和触杀作用的一种苯脲类除草剂，该除草剂主要用于防治禾本科和阔叶杂草。研究表明，敌草隆的滥用会对生态环境、人体健康造成威胁，因此在农业生产中，对其最大残留限量有严格规定[1,2]。目前，用于敌草隆检测的方法主要是色谱法[3 - 6]，该方法虽然可以实现有效测定，但是需要昂贵的仪器，操作繁琐。此外还发展了免疫法[7,8]和电化学法[9,10]。其中，电化学法因其具有测定成本低、灵敏度高、响应速度快、操作简便等优点，在农药残留检测方面具有较大优势，特别是基于分子印迹技术的电化学传感器[11,12]。

为了提高分子印迹传感器的灵敏度，各种纳米材料被用于修饰电极表面，以增大电极表面积，提高电子传递速率和表面附着能力[13,14]。与传统的石墨烯基纳米材料相比，三维氮掺杂石墨烯(3DNGH)呈现出三维网状空间结构，具有较大的比表面积，良好的耐腐蚀性和高导电性，是一种理想的电极修饰材料，近年来基于3DNGH修饰的传感器已被用于食品安全分析检测[15,16]。本文以石墨粉、Zn(NO3)2和甘氨酸为原料，制备了氧化锌三维氮掺杂石墨烯(ZnO/3DNGH)，并以其作为电极增敏材料。以邻氨基苯酚为功能单体，敌草隆为模板分子，通过电聚合法在ZnO/3DNGH修饰的玻碳电极(GCE)表面制备了敌草隆分子印迹电化学传感器(Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE)，并将该传感器用于实际样品测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

场发射扫描电镜(FEI Quanta FEG 250，美国Thermo fisher)；X射线衍射仪(D8 Advance，德国Bruker)；傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet Is10，美国Thermofisher)；电化学工作站(CHI660E，上海辰华仪器有限公司)；冷冻干燥机(IEC1010-1，美国Labconco)。

325目石墨粉(青岛华泰润滑密封科技有限责任公司)；敌草隆、异丙隆、伏草隆、噻虫胺、联苯菊酯(北京坛墨质检科技有限公司)；甘氨酸、Zn(NO3)2·6H2O、邻氨基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺等试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 ZnO/3DNGH的制备首先采用改良后的Hummers法[17]，分低温、中温、高温三部分合成制备氧化石墨烯(GO)，再以GO、Zn(NO3)2和甘氨酸为原料，采用水热还原法一步制备ZnO/3DNGH[18]。将100 mg甘氨酸加入至10 mL含有20 mg GO的分散液中，分散均匀后，加入80 mg Zn(NO3)2，再超声30 min，随后置于180 ℃反应釜中反应12 h，反应产物洗涤数次后，采取梯度升温的方式冷冻干燥48 h，得到固态ZnO/3DNGH，密封保存。

1.2.2 敌草隆分子印迹传感器的制备依次用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上对玻碳电极(GCE)进行抛光打磨至镜面后，用超纯水超声冲洗干净，氮气吹干，再在其表面滴涂5 μL 2 mg/mL的ZnO/3DNGH分散液，37 ℃自然晾干，即得到ZnO/3DNGH/GCE。将ZnO/3DNGH/GCE置于10 mL含有25 mmol/L的敌草隆，75 mmol/L的邻氨基苯酚甲醇溶液中，在-0.2～1.0 V间以50 mV/s扫速循环扫描聚合35圈，用超纯水冲洗数遍，再置于8∶1的甲醇-HAc溶液中，采用电流-时间曲线法，设置采样间隔0.1 s，-0.2 V的恒电位洗脱360 s，即得到敌草隆分子印迹传感器(Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE)，如图1所示。除了不添加敌草隆，非印迹传感器(NMIP/ZnO/3DNGH/GCE)的制备与印迹传感器制备方法相同。

图1 分子印迹传感器检测敌草隆原理图Fig.1 Schematic diagram of detection diuron with molecularly imprinted sensor

1.2.3 电化学测试将传感器置于含有敌草隆溶液中孵育一定时间后取出，用超纯水冲洗表面，然后进行电化学测量。每次测试后都应将电极置于洗脱液中进行洗脱，再用超纯水冲洗干净，待继续使用。采用三电极体系：GCE(φ=3 mm)或其修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极。在含有5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.2 mol/L KCl的探针溶液中进行电化学行为测试。

差分脉冲伏安法(DPV)设置扫描电位为-0.2～0.6 V，电位增量为0.004 V，振幅为0.05 V，脉冲周期为0.2 s，采样宽度为0.0167 s。循环伏安法(CV)设置扫描范围为-0.2～0.6 V，扫描速率为0.05 V/s。电化学阻抗法(EIS)设置频率范围为0.1 Hz～100 kHz，振幅为5 mV。

1.2.4 传感器动力学性能测试将制备好的传感器放置于含有5.0×10-4mol/L目标物的溶液中进行孵化，每间隔2 min后，在K3[Fe(CN)6] 溶液中进行DPV法检测，记录每次检测的峰电流，依照Langmuir吸附模型，对孵化时间和分子印迹传感器电流变化值(ΔI)进行动力学曲线拟合[19]。

2 结果与讨论

2.1 ZnO/3DNGH扫描电镜表征

如图2A，GO呈现出比较紧密的片层结构，且片层较厚，横向面积大，有部分褶皱。从图2B中可看出，ZnO/3DNGH呈现出明显的成交联孔状的三维结构。从图2C中可以看到表面附着有ZnO颗粒。从能谱图中可看出，C元素(图2D)、N元素(图2E)及Zn元素(图2F)在ZnO/3DNGH表面分布均匀，证明了C元素和N元素成功掺入，与上述表征结果一致。

图2 GO(A)、ZnO/3DNGH复合材料(B、C)的扫描电镜(SEM)图像；ZnO/3DNGH复合材料中C元素(D)、N元素(E)和Zn元素(F)Fig.2 SEM images of GO(A) and ZnO/3DNGH composites(B,C);C element(D),N element(E) and Zn element(F) of ZnO/3DNGH composites

2.2 分子印迹传感器的电化学行为分析

2.2.1 循环伏安法分析邻氨基苯酚与敌草隆的循环伏安电聚合过程如图3所示，邻氨基苯酚与敌草隆可借助氨基和羟基形成弱氢键结合，在0.63 V处有一个十分明显且不可逆的邻氨基苯酚的氧化峰。随着电聚合不断进行，此氧化峰不断减小。这是因为在ZnO/3DNGH修饰的GCE表面形成了一层致密并且导电性差的聚合膜，阻碍了底液内电子的传递。

图3 敌草隆分子印迹邻氨基苯酚的电聚合循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of electropolymerization process of diuron molecularly imprinted o -aminophenol

采用循环伏安法对传感器制备过程中，不同修饰电极在背景溶液中的电化学行为进行研究，结果如图4所示。由于在GCE表面修饰了比表面积大、导电能力强的ZnO/3DNGH，致使峰电流得到了明显增加(曲线b到曲线a)；而当致密且不导电的分子印迹膜在电极表面形成并覆盖于其表面后，极大地阻碍了电子的传递，探针离子到达电极表面变得十分困难，因此峰电流急剧变小(曲线a到曲线c)；当模板分子被洗脱后，印迹膜上便留下了具有特异性识别的孔穴作为电子传递的通道，响应峰电流变大(曲线d)。对非分子印迹膜而言，由于洗脱前后，并未产生印迹位点，故前后电流几乎不发生变化(曲线e到曲线f)。以上结果说明了MIPs已成功制备并覆盖在电极表面，并且可以对敌草隆产生响应。

图4 不同电极的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of different electrodesa.ZnO/3DNGH/GCE;b.bare GCE;c.MIP/ZnO/3DNGH/GCE;d.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE;befor(e) and after(f) elution of NMIP/RGO/GCE.

2.2.2 交流阻抗分析电化学阻抗是表征电极表面电子转移动力学的一种有效方法。高频区的半圆直径代表电荷转移电阻大小，低频区的线性范围描述了扩散过程。如图5所示，当电极表面修饰ZnO/3DNGH后，与裸GCE(149.13 Ω，曲线b)相比，电阻值明显变小(70.6 Ω，曲线a)。这时由于ZnO/3DNGH具有较大的比表面积，提高电子传递速率。当致密且不导电的分子印迹膜在电极表面形成并覆盖于其表面后，电极表面的电阻急剧增大(982.7 Ω，曲线c)；洗脱除去模板分子敌草隆后，印迹孔穴出现，电子又有了传递的通道，使得电极表面的电阻再次变小(335.42 Ω，曲线d)，阻抗结果与上述循环伏安法表征结果一致。

图5 不同电极的交流阻抗(EIS)图Fig.5 EIS diagrams of different electrodesa.ZnO/3DNGH/GCE;b bare GCE;c.MIP/ZnO/3DNGH/GCE;d.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE.

2.3 实验条件的优化

2.3.1 模板分子与功能单体摩尔比的影响模板分子与功能单体比例影响着聚合膜特异性结合位点的形成。固定敌草隆浓度为25 mmol/L，改变聚合液中敌草隆与邻氨基苯酚的摩尔比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，考察其峰电流变化情况。结果表明，随着比例的不断减小，ΔI呈现先增后降的变化趋势，这可能是由于单体的数量太少，不能结合足够的模板分子。而过量的单体可能占据了电极表面，使得有效的识别位点减少，不利于背景溶液中探针离子与电极表面的电子传递,因而响应电流减小。所以选定模板分子与功能单体的最佳摩尔比为1∶3。

2.3.2 电聚合扫描圈数的影响考察了不同电聚合扫描圈数对传感器的性能影响。结果表明，随着聚合圈数的增加，ΔI呈现先增后降的趋势，35圈时峰电流变化量达到最大值，这可能是由于聚合圈数过少，使得膜的厚度较薄，产生的印迹位点少；若聚合圈数过多，膜就会较厚，印迹上去的模板分子易被包埋，难以洗脱，进而影响到传感器的电流响应信号，故35圈为最佳扫描圈数。

2.3.3 洗脱液体积比与洗脱时间的影响为了考察不同体积比的甲醇-乙酸洗脱液对模板分子洗脱效果的影响，分别选择甲醇-HAc体积比为6∶4、7∶3、8∶2、8∶1、9∶1进行洗脱。当甲醇-HAc体积比为8∶1时，洗脱前后ΔI最大，表明洗脱效果最好。此外在优化后的洗脱液中考察了洗脱时间对传感器性能的影响，结果表明，随着洗脱时间的增加，ΔI变大，说明印迹孔穴逐渐在增多，当洗脱时间超过360 s，ΔI不再有明显的变化，这表明印迹膜中的敌草隆已全部被洗脱。因此，选择360 s为最佳洗脱时间。

2.4 传感器对农药的检测性能分析

2.4.1 传感器对敌草隆的识别动力学研究考察了印迹传感器和非印迹传感器对敌草隆的识别动力学。如图6所示：随着吸附时间增加，印迹传感器电流变化较为明显，10 min后趋于稳定，而非印迹传感器峰电流几乎未发生变化。这是由于印迹传感器表面具有特异性空穴所致。依据平衡时响应电流变化值，计算Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE对NMIP/ZnO/3DNGH/GCE的印迹因子α为8.188，说明传感器对目标分子的印迹能力较好。

图6 Diuron -MIP/ZnO/3DNGH/GCE与NMIP/ZnO/3DNGH/GCE对敌草隆的识别动力学曲线Fig.6 Recognition kinetic curves of diuron at Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE and NMIP/ZnO/3DNGH/GCEa.Diuron-MIP/ZnO/3DNGH/GCE；b.NMIP/ZnO/3DNGH/GCE.

2.4.2 传感器的选择性实验选取与敌草隆结构类似的异丙隆(Isoproturon)和伏草隆(Fluometuron)，以及与敌草隆结构差异大的联苯菊酯(Bifenthrin)和噻虫胺(Clothianidin)作为干扰物质，将多个传感器分别浸入相同浓度(0.01 mmol/L)的敌草隆以及干扰物质溶液中，采用DPV法观察其对电流响应的变化，计算传感器吸附前后ΔI，以考察传感器的选择性。结果显示，敌草隆引起的电流信号变化最大，其次是异丙隆和伏草隆，而联苯菊酯和噻虫胺几乎没有影响。这是由于异丙隆与伏草隆是敌草隆的结构类似物，能部分吸附到传感器上的识别孔穴内，而联苯菊酯与噻虫胺与敌草隆结构差异大，不能识别吸附到传感器孔穴内，故引起电流变化小。以上表明本实验制备的敌草隆分子印迹传感器的选择性良好。

2.4.3 敌草隆电流响应范围及工作曲线在优化实验条件下，记录传感器吸附不同浓度敌草隆后的DPV信号值，重复测定三次，结果如图7所示，吸附前后ΔI与敌草隆在5.0×10-10～5.0×10-5mol/L浓度范围内的对数呈现出良好的线性关系，线性方程为:ΔI=11.459logc+106，相关系数r=0.9959，该方法的检出限(S/N=3)为4.12×10-10mol/L。

图7 Diuron-MIP/ZnO/3DNGH在不同浓度的敌草隆溶液中的差分脉冲伏安(DPV)图Fig.7 DPV of Diuron -MIP/ZnO/3DNGH/GCE in different concentrations of diuron solutionsa→g：0.0×10-10，5.0×10-10，5.0×10-9，5.0×10-8，5.0×10-7，5.0×10-6，5.0×10-5 mol/L.

2.4.4 样品检测将上海青捣碎处理后，准确称取10.0 g，用10.0 mL甲醇振摇提取10 min，离心后取上清液至25 mL容量瓶中，残渣再加入10 mL甲醇振摇提取10 min，合并上清液，甲醇定容，制得样品溶液备用。在最佳条件下，采用本方法对样液进行检测，未检测出敌草隆。加标回收实验结果见表1，不同加标浓度下的回收率为96.25%～98.28%，相对标准偏差(RSD)<3.8%，说明此方法具有较高的准确度和精密度，可用于实际样品中敌草隆的检测。

表1 样品检测和加标回收实验结果(n=3)

3 结论

本文构建了一种基于三维石墨烯的分子印迹传感器，与大多数文献报道的印迹电化学传感器相比，该传感器具有较宽的线性范围，对模板分子敌草隆具有良好的特异性识别作用，而且重复性和稳定性令人满意，为敌草隆的痕量测定提供了一种基于电化学的快速、灵敏方法。所建方法用于实际样品测定，加标回收率为96.25%～98.28%，相对标准偏差<3.8%，有望应用于实际样品中敌草隆残留量的检测。