朱道仙 ， 刘 莉 , 赵学刚 ， 陆 江 ， 卢 炜 ， 刘 静

(1.江苏农牧科技职业学院动物医学院 ， 江苏 泰州 225300 ； 2.江苏农牧科技职业学院宠物科技学院 ， 江苏 泰州 225300)

慢性肾衰竭(Chronic renal failure,CRF)表现为肾功能减退，代谢废物潴溜，水、电解质和酸碱平衡失调，以及与肾脏有关的多种内分泌功能失调，以至于不能维持机体内环境的稳定而引发的临床综合征[1]。近年来，宠物犬的慢性肾衰竭发病率逐年上升，治疗费用较高，治疗效果较差，对宠物诊疗工作者和宠物主人均产生了严峻的挑战。微炎症状态是指机体内存在低水平、持续性的炎症状态，但无炎症表现，表现为促炎因子(如IL-1、IL-6及TNF-ɑ等)升高。大量研究发现，氧化应激损伤与微炎症状态是慢性肾衰竭发生发展的重要因素，并且与预后密切相关[2-3]。大黄素是中药大黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[4]。临床试验结果显示，大黄素对不同动物的CRF治疗效果不一，对人的CRF具有一定疗效[5]，而对猫的CRF无治疗价值[6]。大黄素是否可通过抑制氧化应激和微炎症状态改善犬的CRF未见文献报道。因此，本试验通过收集犬CRF临床病例并给予大黄素进行干预治疗，探讨大黄素对CRF患犬氧化应激和微炎症状态的影响，为大黄素在犬肾脏疾病中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料 选取2018年1月—2019年7月于江苏农牧科技职业学院教学宠物医院就诊的按国际肾病研究协会(IRIS)犬猫慢性肾病诊断标准[7]诊断为慢性肾衰竭的患犬47例。所有用于研究病例的主人均对本试验计划有详细的了解，并签署知情同意书。

1.2 试验方法 按随机数字表法将47例病例随机分成4个治疗组：常规治疗组(UT组，n=8)、低剂量大黄素治疗组(LRT组，n=12)、中剂量大黄素治疗组(MRT组，n=12)和高剂量大黄素治疗组(HRT组，n=15)；同时选择10例健康犬作为对照组(CG组)。UT组患犬治疗方案为口服复方α-酮酸片(河北天成药业有限公司，1片/次，2 次/d)+自由采食肾脏处方粮(上海信元动物药品有限公司生产)；LRT组、MRT组和HRT组分别在UT组治疗基础上按25、50 mg/(kg·bw·d)和100 mg/(kg·bw·d)口服大黄素(西安嘉和生物技术有限公司，大黄素含量≥98%)。治疗期间所有动物自由饮食，试验期15 d。

1.3 样本采集与指标测定 治疗前和治疗后，空腹采集血液用ELISA法检测血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平；化学比色法测定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)；ELISA检测血清炎症因子C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。同时采集尿液用ELISA检测尿8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)、肌酐(Cr)和尿肾脏损伤因子-1(KIM-1)含量。尿中8-OH-dG浓度的最终数值采用Cr值较正，单位为ng/mg Cr。

1.4 数据处理 结果用“平均值±标准差”表示,采用SPSS 22.0统计软件ANOVA程序单因素方差分析进行组间比较，治疗前后比较采用配对t检验分析，分类资料用卡方检测，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。各检测指标的变化幅度=(治疗后水平-治疗前水平)/治疗前水平×100%。

2 结果

2.1 大黄素对CRF患犬肾功能的影响 结果如图1所示，各治疗组的Scr、BUN和KIM-1水平治疗后均低于治疗前(P<0.05)。治疗后比较，HRT组Scr水平低于MRT组、LRT组和UT组(P<0.05)，降低幅度依次为HRT组>MTR组≥LRT组≥UT组(图1A)；HRT组BUN水平低于其他3个治疗组(P<0.05)， MRT组BUN低于LRT组和UT组(P<0.05)，降低幅度依次为HRT组>MTR组>LRT组≥UT组(图1B)；HRT组KIM-1水平低于其他3个治疗组(P<0.05)，降低幅度依次为HRT组>MTR组≥LRT组>UT组(图1C)。

图1 各组犬肾功能指标的变化

2.2 大黄素对CRF患犬氧化应激水平的影响 治疗后的结果如表1所示，与UT组比较，HRT组血清MDA和尿液8-OH-dG水平均显著降低(P<0.05)，血清SOD和T-AOC水平均显著升高(P<0.05)，LRT组和MRT组仅MDA水平显著降低(P<0.05)，但各治疗组的MDA、SOD、T-AOC和8-OH-dG水平均与CG组存在显著差异(P<0.05)。经过治疗，HRT组的MDA和8-OH-dG水平比治疗前分别降低了38.6% 和17.2%，SOD和T-AOC水平比治疗前分别升高了19.3%和18.6%，与其他治疗组有统计学差异(P<0.05，图2A)。

表1 治疗后各组氧化应激水平的比较

2.3 大黄素对CRF患犬血清炎症因子水平的影响 治疗后的结果如表2所示，HRT组的CRP水平显著低于LRT组和UT组，IL-6、TNF-α水平显著低于MRT组、LRT组和UT组(P<0.05)；MRT组CRP、IL-6和TNF-α水平均低于UT组(P<0.05)；但各治疗组CRP、IL-6和TNF-α水平均显著高于CG组(P<0.05)。 经过治疗，HRT组的CRP、IL-6和TNF-α水平较治疗前分别降低了40.5%、47.1%和48.2%，与其他治疗组均有显著差异(P<0.05，图2B)。

图2 各治疗组治疗后氧化应激与炎症因子水平的变化程度

表2 治疗后各组血清炎症因子的变化

2.4 肾功能指标与氧化应激及炎症因子的相关性分析 通过Pearson分析肾功能指标与氧化应激及炎症因子指标的相关性，结果发现：Scr、BUN和KIM-1等肾功能指标均与MDA、CRP、IL-6、TNF-α和8-OH-dG呈正相关关系，Scr、KIM-1与SOD呈负相关关系,BUN与SOD、T-AOC均呈负相关关系(图3)。

图3 肾功能指标与氧化应激及炎症因子相关性热图

3 讨论

Scr和BUN分别为肌肉组织代谢终产物和蛋白质代谢产物，由肾小球滤过而排出体外，当患者肾功能不全时，血清中两者含量将会升高，因此检测血清中Scr和BUN的含量即可反映肾小球滤过功能[8-9]。KIM-1是肾脏近曲小管上皮细胞的一种跨膜糖蛋白，在正常肝、脾、肾等组织微量表达，而在受损后的近曲小管上皮细胞中表达增强，是肾小管损伤的重要标志物[10]。通过相关性分析发现，肾损伤指标Scr、BUN和KIM-1与氧化应激指标MDA、微炎症指标CRP、IL-6和TNF-α等呈正相关，提示犬慢性肾衰的发生发展可能与氧化应激和微炎症状态有关。

氧化应激是机体在遭受各种有害刺激后，体内氧化和抗氧化之间的平衡被破坏，引起过多的氧化产物释放，导致组织损伤。近年来研究人员发现，氧化应激对于肾衰竭的发生发展具有促进作用，且随着肾功能损伤严重程度的增加，机体内氧化应激程度亦增强[11]。SOD、T-AOC对氧化应激起到防御作用，MDA是体内脂质过氧化作用的中间产物，这些指标变化反映了机体的氧化应激水平[12-13]。研究表明，慢性肾衰竭可导致机体抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低且MDA含量增加，从而发生氧化应激反应，导致细胞功能受损[14]。本试验发现，大黄素可以增加SOD和T-AOC活性，降低MDA含量，改善CRF犬的氧化应激水平。

微炎症状态指以单核-巨噬细胞系统激活为中心的慢性、持继性炎症发应，主要以CRP、IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的高表达为表现，而无明显临床症状[15]。肾衰时肾脏功能下降，不能很好地清除炎性因子是引起微炎症状态的一个重要因素，而微炎症状态可进一步加剧肾衰的发展。有研究表明，CRP升高程度与炎症的范围或活力呈正相关[16]，IL-6可致肾小球系膜细胞增殖、硬化，加重肾脏疾病[17]，TNF-α在慢性肾衰竭发生发展过程中也发挥重要作用[18]。改善肾衰患犬微炎症状态,对提高其肾功能及生存率具有重要意义。本试验结果显示，大黄素可以显著降低血液中CRP、IL-6和TNF-α水平，减轻CRF的微炎症状态。

在给予大黄素治疗后，CRF患犬血清Scr、BUN和尿液KIM-1水平降低，且呈量效关系，说明大黄素可以提高CRF患犬的肾功能，这可能与大黄素抑制机体氧化应激和微炎症状态有关，具体机制还有待进一步研究。