郭金硕 ， 侯 磊 ， 全 荣 ， 王 菁 ， 韦 莉 ， 刘 爵

(1.北京农学院动物科学技术学院 ， 北京 昌平 102206 ； 2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽传染病防控技术北京市重点实验室 ， 北京 海淀 100097)

2016年，国际病毒分类学委员会将塞内卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)正式更名为A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)[1]，该病毒与猪水疱病(SVA-VD)和流行性暂时性新生仔猪死亡(Epidemic transient neonatal mortality,ETNL)相关[2]。2002年A型塞内卡病毒首次被发现[3]，早期研究认为该病毒是非致病性的，感染后的猪没有明显的临床症状[4]。然而，2015年巴西等多国相继发生塞内卡病毒感染猪的疫情[5-7]，感染猪口鼻部和蹄冠部出现原发性水疱和新生仔猪死亡率升高等现象[8]，同年我国广东省发现第1例SVA感染[3,9]，之后在福建[10]、河南[11]、湖北[12]等地相继检测出SVA，对生猪产区造成了严重危害。

A型塞内卡病毒是无囊膜、单股、正链RNA病毒，是微RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员[13]，基因组大小为7.2 kb，具有单一的开放阅读框(ORF)，能够编码2 181个氨基酸的多肽，经过水解和切割后其包括前导蛋白(L)、结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[3]。VP1蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生中和抗体，具有免疫优势，且在SVA不同毒株中相对保守[2]，因此，VP1蛋白是塞内卡病毒免疫学诊断的重要靶标之一，并且在塞内卡病毒致病机制的研究中具有重要意义[14-15]。本研究利用SVAVP1(528 bp)片段制备出能够稳定分泌抗SVA VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并利用SVA(CHhb17)对杂交瘤细胞株分泌产生的抗体进行Western blotting和间接免疫荧光鉴定，该单克隆抗体的制备为A型塞内卡病毒诊断方法的建立与致病机制的研究提供有效途径。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、质粒和病毒 BHK-21细胞，购自美国细胞菌种库(ATCC CRL-1650)。SP2/0骨髓杂交瘤细胞、表达载体pET30a-GST由本实验室保存。6周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。A型塞内卡病毒毒株CHhb17由本实验室保存。

1.2 试剂BamH I、XhoI，均购自宝生物工程(大连)有限公司。DNA Ligation Kit Ver 2.0,购自TaKaRa公司。NBCS新生胎牛血清、FBS胎牛血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，均购自Thermo-Fisher Scientific公司。IPTG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、单抗亚型鉴定试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗小鼠IgG、HAT选择性培养基，均购自Sigma公司。RNeasy®Mini Kit、DNA片段胶回收试剂盒，均购自QIAGEN公司。TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司。Ni2+亲和层析柱，购自GE公司。

1.3 引物的设计、合成 参考A型塞内卡病毒毒株CHhb17的VP1基因序列(GenBank登录号：MG983756.1)，设计特异性引物，委托中美泰和有限公司合成，在构建原核表达重组质粒的过程中选取BamH I和XhoI为限制性核酸内切酶，引物设计如下：VP1-F(528 bp)：CTCTGGATCCTCCACCGACAACGCCGAG(下划线处为BamH I);VP1-R(528 bp)：GGTGCTCGAGTCCACCCTTGCTGGTGAA(下划线处为XhoI)。

1.4 原核表达载体的构建与鉴定 提取A型塞内卡病毒毒株CHhb17 RNA，并测定RNA浓度，并将其反转录为cDNA，采用PCR技术扩增SVAVP1(528 bp)基因，反应体系20 μL：1 μL模板、2 μL dNTPs、10 μL Buffer、1 μLVP1-F、1 μLVP1-R、0.5 μL聚合酶、4.5 μL ddH2O。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用胶回收试剂盒纯化目的片段。SVAVP1(528 bp)基因片段与原核表达载体pET30a-GST分别用BamH I、XhoI双酶切，纯化回收目的基因片段，将1 μL载体(pET30a-GST)，5 μL酶切回收产物，4 μL连接酶混合物混匀，室温反应30 min以上。重组质粒转化BL21感受态细胞，选择氨苄青霉素抗性的LB涂板，晾干，倒置37 ℃培养箱过夜，挑取菌落用VP1-F、VP1-R引物进行PCR检测，阳性菌进行基因测序。

1.5 VP1蛋白诱导表达与纯化 将测序正确的pET30a-GST-VP1(528 bp)菌株，接种到1 L氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，200 r/min，37 ℃培养。待菌液培养至OD=0.6～0.8，加入浓度为0.5 mmol/L的IPTG中，37 ℃诱导4 h。诱导后离心收菌，超声破碎，再次离心后分别取上清和沉淀，通过12% SDS-PAGE电泳，确定重组蛋白的表达形式。使用Ni2+亲和层析法对重组蛋白进行纯化，为了确定最佳洗脱浓度，采用15、60 mmol/L和500 mmol/L浓度的咪唑进行洗脱，收集流穿液与洗脱液。将制备的样品进行12% SDS-PAGE电泳鉴定，然后将纯化的蛋白作为抗原免疫小鼠，剩余的置于-80 ℃保存备用。

1.6 小鼠免疫与细胞融合 纯化后的重组蛋白按照1∶1的比例与弗氏完全佐剂充分乳化，初次免疫4只 6周龄雌性 BALB/c小鼠，背部皮下多点注射，每只免疫30 μg，二免和三免使用弗氏不完全佐剂与重组蛋白以1∶1的比例充分乳化，采用相同的免疫方法，免疫间隔为3周，三免14 d后采血，进行免疫效价检测，小鼠编号为1、2、3、4，将纯化的重组蛋白进行ELISA检测，当小鼠血清OD450 nm/阴性对照OD450 nm>2.1，判定为阳性，采用聚乙二醇(PEG)法对血清效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，融合细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养，通过间接ELISA的方法筛选出阳性细胞孔，按照有限稀释法进行连续3次亚克隆纯化，直至杂交瘤细胞阳性率达到100%且为单个克隆，从而获得能够稳定分泌抗SVA VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，最后通过单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定。

1.7 腹水制备与纯化 以0.5 mL/只石蜡油腹腔注射6周龄雌性BALB/c小鼠，10 d以后用同样的方法腹腔注射阳性杂交瘤细胞，7～10 d后采集小鼠腹水，离心后取上清，经过辛酸-硫酸铵法和Protein G柱对抗体进行纯化，纯化后的单抗样品用12% SDS-PAGE电泳鉴定。

1.8 单克隆抗体的特异性鉴定 Western blotting检测:使用含有10% FBS的DMEM培养基在6孔板中培养单层BHK-21细胞，弃去培养基，SVA感染细胞1 h，换用含有2% FBS的DMEM维持培养基培养细胞，阴性对照为含有2% FBS的DMEM维持培养基培养的单层BHK-21细胞，培养24 h，裂解细胞制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳与转膜，最后进行显影以及图像采集。

1.9 间接免疫荧光检测 在24孔板中使用10% FBS的DMEM培养单层的BHK-21细胞，待长至90%以上，弃去培养基，SVA感染细胞1 h，弃掉培养基，使用含有2% FBS的DMEM维持培养基培养细胞，阴性对照为含有2% FBS的DMEM维持培养基培养的单层BHK-21细胞。病毒感染24 h后无水乙醇固定30 min，PBST洗3次，5 min/次，加入抗SVA VP1单克隆抗体，37 ℃孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，然后加入抗小鼠IgG-FITC标记抗体(1∶50倍稀释)，37 ℃避光孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，封片镜检，观察结果。

2 结果

2.1 pET30a-GST-VP1(528 bp)重组质粒的构建 以SVA RNA反转录的cDNA为模板，用VP1-R/VP1-F引物通过PCR的方法扩增SVAVP1 (528 bp)基因，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在500 bp左右出现1条特异性条带，与预期SVAVP1 (528 bp)基因大小相近(图1)。

图1 VP1基因(528 bp)PCR扩增产物

2.2 重组SVA VP1蛋白的诱导表达 将扩增的SVAVP1 (528 bp)基因构建到原核表达载体pET30a-GST上，重组pET30a-GST-VP1 (528 bp)质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，经过IPTG大量诱导表达重组蛋白，最后通过12% SDS-PAGE检测蛋白表达情况，结果显示：重组蛋白主要在沉淀中，以包涵体的形式存在，大小约为47 kDa，与预期蛋白大小一致(图2A)。将其尿素溶解后透析复性，经镍柱纯化，使用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，最后进行12% SDS-PAGE电泳分析，结果显示，本研究得到了纯化的重组蛋白(图2B)。

图2 VP1重组蛋白的12% SDS-PAGE分析

2.3 单克隆抗体的制备 将纯化的VP1重组蛋白乳化后免疫BALB/c小鼠，经过3次免疫后，测量小鼠血清效价。经检测1号小鼠的血清效价最高，约为5×104。取1号小鼠脾细胞与SP2/0细胞通过PEG方法进行细胞融合，融合以后用含HAT半固体培养基进行筛选培养，经过间接ELISA方法进行3轮亚克隆筛选，得到1株能分泌抗VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，将筛选出的单抗进行亚型鉴定，结果显示其重链亚型为IgG2a，轻链为Kappa链(表1)。

表1 抗SVA VP1单克隆抗体亚型鉴定

2.4 单克隆抗体的纯化 收集制备的小鼠腹水，通过辛酸-饱和硫酸铵法与Protein G柱纯化单克隆抗体，经12% SDS-PAGE电泳分析，在55 kDa和26 kDa出现2条清晰的条带，与IgG重链和轻链的大小相符，结果显示得到了纯化的单克隆抗体(图3)。

图3 纯化的VP1单抗的SDS-PAGE分析

2.5 单克隆抗体的鉴定 Western blotting检测结果如图4A所示，在29 kDa处出现明显的条带，与病毒编码的SVA VP1蛋白大小相符，说明该单抗能够与SVA编码的VP1蛋白结合。间接免疫荧光鉴定结果如图4B所示，病毒感染细胞后，单克隆抗体可以使感染病毒的细胞产生特异性荧光，且与正常的BHK-21细胞无反应，证明该单克隆抗体能识别SVA病毒粒子。

图4 VP1单克隆抗体的鉴定

3 讨论

SVA感染后的临床症状主要为肌肉无力、嗜睡、跛行、厌食、鼻部和蹄部冠状带出现水泡甚至溃疡[16-18]，新生仔猪发病率高达70%，死亡率介于15%～30%，并伴有腹泻症状[19]，与其他水泡病病毒，如口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、猪水泡性疱疹病毒(VESV)的感染难以区分，需要进行鉴别诊断，因此发展SVA血清学检测手段尤为重要，而单克隆抗体具有纯度高、稳定性强、特异性强和易于标准化生产的优点，可以广泛应用于A型塞内卡病毒各个方面的研究。

在微RNA病毒科中VP1蛋白普遍具有良好免疫原性，例如FMDV的VP1蛋白[20-21]，并且经常被用作候选疫苗研究的目标蛋白[22]。SVA VP1蛋白的氨基酸序列在所报道的SVA毒株中高度保守，相似性为95.8%～100%，而与其他微RNA病毒科的其他成员相似性小于30%(例如心脏病毒)，易与其他微RNA病毒区分开，且SVA VP1蛋白能够刺激机体产生中和抗体[2]，因此本研究选择VP1蛋白用于制备SVA的单克隆抗体。与真核表达系统相比，原核表达系统具有翻译后修饰的缺陷，例如构象结构缺失、甲基化修饰缺失等，但优点是菌株生长快，易于操作和蛋白质生产量大[23]，因此本研究通过大肠埃希菌大量表达了SVA VP1蛋白。但是在本研究中，构建原核表达重组质粒时全长基因不能很好的表达SVA VP1蛋白，通过生物信息软件分析，SVAVP1 148～675 bp 区域具备抗原性、亲水性基因优势，因此将VP1基因截短，即截取全长的528 bp，去除存在疏水区的基因序列，成功表达SVA VP1蛋白。载体中连接GST基因，构建的重组蛋白中包含GST蛋白，研究制备的单克隆抗体有可能针对GST蛋白，但在单克隆抗体的鉴定时，病毒编码的VP1蛋白可以与单克隆抗体结合，因此该抗体具备识别的特异性，不与GST蛋白结合。另外本研究通过氨基酸序列比对，SVAVP1 (528 bp)与FMDVVP1氨基酸序列同源性为14.2%，SVAVP1(528 bp)与SVDVVP1氨基酸序列同源性为11.4%，表明SVAVP1序列与另外2个病毒的VP1同源性较低，抗SVA VP1单克隆抗体与另外2个病毒VP1反应性较低。

本研究利用大肠埃希菌原核表达系统获得高纯度的SVA VP1蛋白，通过小鼠免疫，细胞融合制备出SVA VP1单抗，该单抗可用于Western blotting和间接免疫荧光检测，能够与SVA感染的BHK-21细胞发生特异性反应，且不与未感染的BHK-21细胞发生反应，具有良好的反应性和特异性，为深入研究SVA VP1蛋白的结构、功能以及A型塞内卡病毒的鉴别诊断、致病机制的研究提供技术储备。