张小波 ， 温贵兰 ， 张喜懿 ， 陈 广 ， 刘蔓蔓 ， 胡 璇 ， 孙 芸

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州 贵阳 550025 ； 2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室 ， 贵州 贵阳 550025)

2020年8月，贵州省某养鸡场部分鸡只出现流泪、呼吸困难，少数鸡只鸡冠痘状结痂，精神沉郁，采食量与饮水量均减少，其余部分鸡只无明显症状。通过对送检病鸡进行实验室诊断确诊为J亚型禽白血病病毒(Avian leucosis virus J,ALV-J)、血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FWPV)的混合感染。

1 材料与方法

1.1 病料 病料采自贵州省毕节市某养鸡场，送检麻黄鸡保存于贵州大学预防兽医学实验室。

1.2 实验室剖检与细菌分离 对病鸡进行解剖并于无菌环境采集病鸡的鸡冠、肝脏、心脏、脾脏和肾脏等组织接种于LB固体培养基中，置于37 ℃厌氧或需氧培养箱培养12～24 h后观察。

1.3 引物设计 参考GenBank数据库中ALV-J原型毒株HPRS-103(登录号：Z46390)gp85基因序列、FAdV-4(登录号：GU188428.1)penton基因序列和FWPV(登录号：NC-002188.1)TK基因序列分别设计3对特异性扩增引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR鉴定 按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书对病鸡组织提取总DNA和总RNA，再依据HiFi-Script cDNA第1链合成试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，用所设计的3对特异性扩增引物分别对所得cDNA进行PCR扩增，其扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 目的基因克隆及序列测定 将电泳鉴定后的PCR产物切胶进行胶回收，胶回收产物连接至pMD19-T载体，16 ℃过夜连接后，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，其菌液在氨苄固体培养基上培养12 h后，挑取单个白色菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养12～16 h，取纯培养菌液2 μL进行PCR鉴定，选取阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 基因遗传进化分析 将测序所得结果上传于NCBI上进行比对，利用MEGA 7.0分析同源性，并构建其遗传进化树。参考毒株信息见表2、3、4。

表2 ALV-J gp85基因参考毒株信息

2 结果

2.1 实验室剖检与细菌分离 实验室剖检可见鸡冠痘状结痂(图1)、肝脏肿瘤结节(图2)、心包积液(图3)、脾脏肿大(图4)等明显症状。对送检病鸡进行细菌分离培养，结果显示无菌落形成。

图1 鸡冠痘状结痂

图2 肝脏肿瘤结节

图3 心包积液

图4 脾脏肿大

2.2 ALV-Jgp85基因克隆与分析 由图5可知，克隆菌液在1 061 bp处出现特异性的扩增条带，与目的基因预期大小相符，将其命名为GZ-ALV-J gp85-Z。经测序拼接后获得长度为924 bp的基因序列，上传至GenBank中进行核苷酸同源性比对，结果如图6所示，GZ-ALV-J gp85-Z与国内外ALV A、B、C、D、E亚群的同源性仅为50.1%～52.0%，GZ-ALV-Jgp85-Z与ALV-J亚群参考株属于同一分支，同源性为93.8%～99.7%，其中与国内HuB09 JY04株亲缘性最近，为99.7%，表明该分离株属于ALV-J亚群。

表3 FAdV-4 penton基因参考毒株信息

表4 FWPV TK基因参考毒株信息

图5 ALV-J gp85基因的PCR鉴定

图6 GZ-ALV-J gp85-Z系统进化树

2.3 FAdV-4penton基因克隆与分析 由图7可知，克隆菌液在717 bp处出现特异性的扩增条带，与目的基因预期大小相符，将其命名为GZ-FAdV-4 penton-X。经测序后获得长度为717 bp的基因序列，上传至GenBank中进行核苷酸同源性比对，结果如图8所示，GZ-FAdV-4 penton-X与国内外禽腺病毒A、B、D、E基因型的同源性为71.4%～75.3%，与C型禽腺病毒血清4型属于同一分支，且与国内C型禽腺病毒血清4型参考株的同源性均高达98%以上，表明GZ-FAdV-4 penton-X分离株为C型禽腺病毒血清4型。

图7 FAdV-4 penton基因的PCR鉴定

图8 GZ-FAdV-4 penton-X系统进化树

2.4 FWPVTK基因克隆与分析 由图9可知，克隆菌液在750 bp处出现特异性的扩增条带，与目的基因预期大小相符，将其命名为GZ-FWPV-TK-B。经测序后获得长度为750 bp的基因序列，上传至GenBank中进行核苷酸同源性比对，结果如图10所示，GZ-FWPV-TK-B与美国株FWPV-SD15-670.2(登录号：MH734528.1)的同源性最高，达99.49%，与禽痘病毒属于同一分支，亲缘关系较近，而与其他不同属的痘病毒(如猪痘病毒等)不属于同一分支，表明亲缘关系较远。

图9 FWPV TK基因的PCR鉴定

图10 GZ-FWPV-TK-B系统进化树

3 讨论

通过对送检病鸡进行细菌分离培养，并进行FWPV、ALV-J、FAdV-4的PCR实验室检测，结果显示该养鸡场存在FWPV、ALV-J和FAdV-4混合感染。基于此情况，应当尽快对养殖场病鸡进行紧急淘汰，对健康鸡只进行FWPV和FAdV-4疫苗接种，并对整个鸡舍进行ALV净化，同时对养鸡场环境彻底消毒，严防引进销售，阻止扩散，及时止损。

由于近年来病原不断迁移，基因组不停变异，宿主范围不断扩大，ALV宿主范围已不仅仅局限于家禽，野生鸟类也时有报道[1]。ALV亚群众多，病毒传播快，因此其快速检测方法和亚群鉴定就应运而出，如具有高度敏感性的分型方法PCR-RFLP，能快速、敏感、特异地对样品中的病毒进行检测与分型[2]。还有其他一系列分子生物学方法如环介导等温扩增、斑点杂交、基因芯片等[3-4]，都可以对ALV进行特异性地快速检测，但由于价格、适用性等原因，没有普遍应用于市场。ALV属于C型反转录病毒，其env基因编码的gp85囊膜糖蛋白与宿主的易感性病毒中和反应密切相关，决定着亚群特异性，但由于存在高变区，极易发生变异，因此gp85基因的变异常常代表着ALV毒株的流行变异。本试验采用PCR检测及ALV-Jgp85基因克隆、测序分析，结果显示，该分离株与国内外J亚群参考株同源性为93.8%～99.7%，而与国内外其他亚群A、B、C、D、E同源性仅为50.1%～52.0%。与其他亚群超低同源性也与相关学者何成伟等[5]、林汉卿等[6]报道一致，证实了gp85基因存在高度突变性，其遗传变异性也可为养殖场引种提供参考。

FAdV-4感染鸡引起鸡心包积液-肝炎综合征，从1987年报道流行后，至今已有40多个国家和地区都有暴发。自2014年以来，我国山东、河南、江西等地相继有安卡拉病的暴发流行，并依次向周边省份传播，范围还在不断扩大，养禽业至今遭受其害[7]。目前由于该病临床易与鸡传染性肝炎混淆，又极易与禽白血病、传染性法氏囊病、大肠埃希菌病等继发感染，因此实验室以临床剖检、病变观察结合PCR检测等对FAdV-4进行临床快速检测，提高对病原的检测效率。五邻体(Penton)所在头节区能识别细胞表面的病毒受体，在病毒入侵宿主机体的过程中起着很大作用[8]。本试验将FAdV-4分离株penton基因进行克隆测序后得到717 bp的基因片段，通过同源性比较和系统进化树分析发现，其与国内外禽腺病毒A、B、D、E基因型的同源性为71.4%～75.3%，与C型禽腺病毒血清4型属于同一分支，与国内C型禽腺病毒血清4型参考株的同源性均高达98%以上，亲缘关系较近。表明该阳性毒株为血清4型禽腺病毒。

本试验对鸡冠皮肤结痂进行PCR检测，结果呈阳性。对目的基因TK进行克隆、测序和基因同源性分析表明，分离株与美国株FWPV-SD15-670.2(登录号：MH734528.1)的同源性最高，达99.49%。这株美国分离株从野生型梅里亚姆火鸡分离得出，经研究证实为自然感染过程中禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)基因组片段整合进了FWPV基因组内[9]。且国内也有研究证实，REV整合入FWPV疫苗株和野毒株的现象普遍，可能是由FWPV重组期间REV LTRs之间的同源重组，从FWPV基因组中复制或通过逆转录病毒切除[10]。因此禽痘病毒在不同国家、地区间变化依旧复杂，本试验分离株是否有外源基因植入仍有待进一步研究。

基于细菌分离及PCR检测，初步判定该病鸡为FWPV、ALV-J和FAdV-4混合感染，并进行了FWPVTK、ALV-Jgp85、FAdV-4penton片段的序列分析，但由于混合感染多病毒毒株分离存在一定的难度，且分离方法不一致，因此未进行病毒分离，后期将会报道其病毒的分离情况，以期为丰富该混合感染病例的防控措施提供参考资料。