刘 茹，李小龙,张晓倩，田小欢，余 梅,3，赵书红,3，曹建华,3

(1.华中农业大学，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；2.华中农业大学，农业农村部猪遗传育种重点实验室，武汉 430070；3.华中农业大学，生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070)

Cas12a(原名Cpf1)蛋白是CRISPR效应蛋白，该家族已被鉴定出46个种属，在基因编辑领域应用较广泛的有3种，分别是毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)LbCas12a、氨基酸球菌属(Acidaminococcussp.)AsCas12a和新凶手弗朗西丝氏菌属(Francisellanovicida)FnCas12a[1]，这3种蛋白显示出类似的结构域特征，其氨基酸数目从1 228到1 307个不等[2-3]。Cas12a识别富含T的原型间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，由CRISPR RNA(crRNA)引导切割靶标双链DNA(dsDNA)[4]。与Cas9蛋白相比，Cas12a具有相似的基因编辑效率，但脱靶效应更低，更具潜在的临床应用价值[5-7]。

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV) 是一种单链线性DNA病毒，属于细小病毒科，它是引起繁殖障碍最常见的感染源之一[8]。PPV给养猪业造成了很大的损失，因此，需要一种有效检测PPV感染的方法。目前常用的检测PPV的技术是常规PCR和实时荧光定量PCR，这些技术在养猪场大规模推广使用存在困难[9]。理想诊断方式的特点是廉价、准确，可以快速提供结果，并且能够对多种样本类型同时检测[10]，因此亟需经济高效的核酸检测工具。LbCas12a被证实当其以序列特异性的方式切割双链DNA(dsDNA)时，会引起非特异性单DNA(ssDNA)的反式切割[11],这为检测ssDNA病毒提供了一种新思路。由于LbCas12a具有DNase和RNase活性，所以LbCas12a只需要1个单独的crRNA(CRISPR-derived RNA)即可完成激活，pre-crRNA形成假结，可被LbCas12a识别和剪切[1,12]。反式切割活性需要LbCas12a/crRNA/靶DNA三元配合物的形成，通过Ruv C核酸酶结构域切割任意靠近的ssDNA[13]。Li等[13]对包含LbCas12a在内的9个种属的Cas12a蛋白进行测试，发现所有蛋白均在质粒dsDNA上表现出了内切酶活性，并且在ssDNA上均具有顺式和反式切割活性，这表明顺式和反式切割ssDNA的活性可能普遍存在于Cas12a蛋白中。CRISPR-LbCas12a系统在分子检测领域中具有较大的应用潜力，是目前LbCas12a蛋白的应用热点之一[14]。利用该蛋白的反式切割特性，配合标记荧光的单链核酸探针，从而实现病原核酸的高灵敏检测。此类研究结果在新冠病毒、非洲猪瘟等病原检测中已取得成功[9,11,15]。本研究通过原核表达系统，利用硫代半乳糖苷IPTG对重组菌进行诱导表达并利用Ni-NTA树脂进行亲和层析纯化，得到高浓度LbCas12a蛋白，并进行了功能活性检测，结果可为进一步利用LbCas12a蛋白进行病原检测提供了研究基础和可行方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 pMBP-LbCas12a质粒购自北京中源合聚生物科技有限公司；pET-28a(+)质粒和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞均购自翌圣生物科技(上海)有限公司；PUC57质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 Gloria Nova HS DNA聚合酶、ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix均购自ABclonal公司；DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；去内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司；NheⅠ、SalⅠ、NEBuffer2.1均购自NEB公司；IPTG购自Biofroxx公司；Ni-NTA Beads 6FF购自SMART公司；超滤管购自Millipore公司；Agencourt AMPure XP Beads购自Beckman Coulter公司；T7 High Yield RNA Transcription kit购自Vazyme公司；Qubit 4.0购自Invitrogen公司；超声波细胞破碎仪购自Sonics公司。

1.2 引物设计与目的基因扩增

参照pMBP-LbCas12a质粒(Addgene，113431)中LbCas12a基因的序列，利用SnapGene 3.2.1软件设计扩增LbCas12a基因的引物，并引入同源臂序列(表1)；参照pET-28a(+)质粒序列，设计反向PCR扩增线性化载体的引物；参照GenBank公布的PPV序列(登录号：NC_001718.1)，利用SnapGene软件设计引物PPV-1和T7-PPV。 引物信息见表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司武汉分公司合成。 用Gloria Nova HS DNA聚合酶进行目的基因扩增。 PCR扩增体系为25 μL：Gloria Nova HS 2×HF Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，质粒模板1 μL，ddH2O补至25 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性45 s；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带。

表1 引物信息

1.3 重组质粒pET28a-LbCas12a的构建

利用SnapGene 3.2.1软件构建pET28a-LbCas12a重组质粒图谱。 将线性化载体pET-28a(+)与目的基因LbCas12a按摩尔比1∶3进行无缝克隆，反应体系20 μL：2×MultiF Seamless Assembly Mix 10 μL，DNA 6 μL，ddH2O补至20 μL。反应条件：50 ℃ 15 min。取5 μL组装产物转化至50 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布至含有卡纳抗性(K+)的LB平板，挑取单菌落于LB(K+)液体培养基中培养，37 ℃培养6 h后送北京擎科生物科技有限公司武汉分公司测序。测序正确的菌液进行重组质粒pET28a-LbCas12a的提取，并利用NheⅠ和SalⅠ进行双酶切，并采用NheⅠ和SalⅠ分别进行单酶切作为阴性对照，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 IPTG诱导条件优化

1.4.1 诱导浓度 将重组质粒pET28a-LbCas12a转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有卡纳抗性的LB平板中，37 ℃过夜培养，次日挑取单菌落于LB(K+)液体培养基中培养，按1∶100的比例转接至5份10 mL新鲜LB培养基中，37 ℃、220 r/min培养至菌液D600 nm值在0.6～0.8之间，依次加入终浓度为0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min诱导4 h，将蛋白样进行12% SDS-PAGE凝胶电泳检测。

1.4.2 诱导温度 采用与1.4.1相同的方式进行菌体培养，选取37和30 ℃ 2个温度分别进行诱导，4 h后收集蛋白进行12% SDS-PAGE凝胶电泳检测。

1.5 重组蛋白表达形式鉴定

在最佳浓度和最佳温度条件下，各取10 mL诱导后的菌液，8 000 r/min离心10 min，弃上清，PBS清洗2次，用1 mL裂解液重悬，加入终浓度为1 mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF，于冰上进行超声裂解，超声功率为35%，超声裂解4 s，静置6 s，多次循环至溶液基本澄清。4 ℃、14 000 r/min离心10 min，用1 mL PBS重悬沉淀，各取50 μL蛋白样进行12% SDS-PAGE凝胶电泳检测。

1.6 重组蛋白纯化与浓缩

收集诱导后的蛋白上清液，用Ni-NTA树脂进行纯化，4 ℃结合4 h后用含不同浓度咪唑(50、150、250、500 mmol/L)的洗脱液进行梯度洗脱，收集纯化后的蛋白于-20 ℃保存。 采用截流量为50 ku的超滤管进行浓缩，将浓缩前后的样品进行12% SDS-PAGE凝胶电泳检测，试验重复3次，采用ImageJ 1.8.0软件对电泳条带进行灰度值分析。浓缩后的样品加入等体积的50%甘油，利用BCA法对蛋白进行定量。

1.7 LbCas12a蛋白活性验证

1.7.1 靶标DNA与crRNA的设计 在NCBI上下载PPV的DNA序列，选取待检测的靶标位点克隆到PUC57质粒上，用PPV-1特异性引物对重组质粒进行扩增。根据PPV DNA的特征，设计长度为50 bp的crRNA，利用T7-PPV引物扩增质粒，合成带T7聚合酶启动子序列的DNA片段，再利用T7转录酶进行体外转录，反应体系为20 μL：10×Reaction Buffer 2 μL，ATP Solution 2 μL，GTP Solution 2 μL，UTP Solution 2 μL，CTP Solution 2 μL，DNA Template 1 μg，T7 RNA Polymerase Mix 2 μL，RNase-free H2O补至20 μL。反应条件为：37 ℃ 2 h。经Ampure XP Beads纯化后，通过Qubit 4.0精确定量。将crRNA产物在70 ℃水浴2 min，立即放入冰上进行骤冷，产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7.2 ssDNA报告探针设计 ssDNA报告探针FQ结构为：5′-端修饰有6-FAM基团，3′-端修饰有BHQ-1淬灭基团，序列为：5′-TTATT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.7.3 LbCas12a蛋白体外活性检测 为了验证浓缩后的LbCas12a蛋白是否具有反式切割ssDNA的活性，将PPV作为靶标位点进行检测。试验设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度梯度(125、250、500、1 000 nmol/L)的试验组，每组各3个重复。 在上述不同浓度的蛋白样品(15.5 μL)中加入2.5 μL 0.5 μmol/L crRNA，2 μL NEBuffer 2.1，37 ℃孵育1 h后形成蛋白RNA复合物(RNP)。加入5 μL ssDNA报告探针FQ和0.5 ng PPV DNA，37 ℃孵育0.5 h。将反应后的样品转移至酶标板，在激发光波长495 nm、发射波波长520 nm条件下检测探针荧光强度。

1.8 数据统计及分析

GraphPad Prism 8.0软件进行t检验，结果以平均值±标准误表示。P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 LbCas12a基因和pET-28a(+)线性化载体扩增结果

以pMBP-LbCas12a质粒为模板扩增LbCas12a基因，扩增得到1条大约为3 733 bp的单一片段，以pET-28a(+)质粒为模板扩增线性化载体，扩增得到1条大约为5 323 bp的单一片段(图1)，与预期大小一致。

2.2 pET28a-LbCas12a重组质粒鉴定结果

重组质粒图谱如图2A所示，同源重组后pET28a-LbCas12a质粒全长9 007 bp。重组质粒在NheⅠ或SalⅠ单酶切条件下均为单带，且大小约为9 007 bp，与预期大小基本一致；重组质粒在NheⅠ和SalⅠ双酶切后，可得到1条约5 323 bp的pET-28a(+)载体条带和约3 733 bpLbCas12a基因条带(图2B)，与预期目的片段大小基本一致，证明重组质粒构建成功。

2.3 重组蛋白表达条件优化及表达形式鉴定

重组蛋白表达条件的优化结果如图3所示。未诱导菌样本总蛋白未见与目标蛋白相对分子质量大小一致的条带，加入IPTG诱导后，均在143 ku左右处出现清晰条带(图3A)，与预期蛋白大小相符，因此，选取最低浓度0.5 mmol/L作为最佳浓度，以期降低IPTG对细胞的损伤。诱导温度在37 ℃时目的蛋白的表达量明显高于30 ℃(图3B)，由此可知最佳诱导温度为37 ℃。在重组菌的上清和沉淀中均观察到143 ku左右的蛋白条带，但是上清中的蛋白表达量高于沉淀中的(图3C)，表明重组蛋白的表达形式主要为可溶性表达。

1,pET-28a(+)扩增产物；2、3，LbCas12a扩增产物；M，DL10000 DNA Marker1,Amplified product of pET-28a(+);2 and 3,Amplified product of LbCas12a;M,DL10000 DNA Marker图1 LbCas12a基因和pET-28a(+)线性化载体的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of LbCas12a gene and pET-28a(+) linearized carrier

①A，重组质粒示意图；B，重组质粒鉴定。②M，DL10000 DNA Marker；1，NheⅠ、SalⅠ双酶切重组质粒；2，NheⅠ单酶切重组质粒；3，SalⅠ单酶切重组质粒①A,Schematic diagram of recombinant plasmid;B,Identification of recombinant plasmid.②M,DL10000 DNA Marker;1,Recombination plasmid by double enzyme digestion;2,Recombination plasmid by NheⅠ digestion;3,Recombination plasmid by SalⅠ digestion图2 pET28a-LbCas12a重组质粒图谱和双酶切鉴定Fig.2 Recombinant plasmid pET28a-LbCas12a map and identification by double digestion

①A，不同浓度IPTG诱导LbCas12a蛋白表达；B，不同温度诱导LbCas12a蛋白表达；C，LbCas12a蛋白表达形式鉴定。②M，Protein Marker；1、6，未诱导菌体；2～5，IPTG诱导浓度分别为0.5、0.6、0.8、1.0 mmol/L；7、8，诱导温度分别为37、30 ℃；9、10，菌液超声破碎后的上清和沉淀①A,LbCas12a protein expression was induced by different concentrations of IPTG;B,LbCas12a protein expression was induced by different temperatures;C,LbCas12a protein expression type identification.②M,Protein Marker;1 and 6,Non induced bacteria;2-5,IPTG induced concentrations were 0.5,0.6,0.8,1.0 mmol/L,respectively;7 and 8,Induction temperature is 37 and 30 ℃;9 and 10,Supernatant and precipitation after ultrasonic crushing of E.coli图3 LbCas12a蛋白表达条件及表达形式的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of LbCas12a protein expression condition and expression form

2.4 重组蛋白纯化与浓缩结果

由图4可知，250 mmol/L咪唑洗脱的重组蛋白在143 ku处条带最清晰(图4A)；灰度值定量分析表明，洗脱液中咪唑浓度为150、250、500 mmol/L时目的蛋白的灰度值均极显著高于50 mmol/L的灰度值(P<0.01)，且250 mmol/L的灰度值最高(图4B)，因此250 mmol/L为最佳咪唑洗脱液的浓度；浓缩后，蛋白浓度明显提升，且蛋白大小为143 ku(图4A)，与预期一致，灰度值定量分析发现，浓缩后的蛋白量极显著高于纯化蛋白(P<0.01)(图4C)。BCA法测定结果表明，重组蛋白的浓度为485 ng/μL。

①A，LbCas12a蛋白纯化条件与浓缩LbCas12a蛋白SDS-PAGE检测；B、C，灰度值分析。②M,蛋白质分子质量标准；1,粗蛋白样；2～6，LbCas12a纯化洗脱液中咪唑浓度依次为50、150、250、500、250 mmol/L；7，浓缩后的LbCas12a蛋白。③与50 nmol/L组或纯化蛋白相比，**，差异极显著(P<0.01)①A,SDS-PAGE detection of LbCas12a protein purification conditions and concentrated LbCas12a protein; B and C, Gray value analysis;②M,Protein Marker;1,Crude protein;2-6,The concentration of imidazole in LbCas12a purified eluent was 50,150,250,500,250 mmol/L,respectively;7,LbCas12a protein after concentration.③Compared with 50 nmol/L group/purification protein,**,Extremely significant difference (P<0.01)图4 LbCas12a蛋白纯化与浓缩结果SDS-PAGE和灰度值分析Fig.4 SDS-PAGE and gray scanning analysis of purification and concentration of LbCas12a protein

2.5 LbCas12a蛋白活性检测结果

2.5.1 crRNA和靶标DNA的扩增结果 靶标PPV的扩增产物如图5A所示，带有T7聚合酶启动子序列的转录模板的扩增产物如图5B所示，两者均在目标大小197、270 bp处显示单一条带，且无杂带。crRNA大小约为50 bp，经1.0%琼脂糖电泳检测，目的条带大小约50 bp(图5C)，说明crRNA转录成功。

A～C，分别为靶标PPV dsDNA、带T7聚合酶启动子序列的转录模板和crRNA鉴定A-C,Identification of target PPV dsDNA,transcription template with T7 polymerase promoter sequence and crRNA图5 靶标PPV dsDNA、转录模板和crRNA的琼脂糖凝胶分析Fig.5 Agarose gel analysis of target PPV dsDNA,transcription template and crRNA

2.5.2 LbCas12a蛋白体外活性检测结果 活性检测示意图如图6A所示，黑色圆圈代表淬灭基团BHQ-1，五角星形状代表荧光基团6-FAM，在LbCas12a/crRNA/dsDNA三元复合物存在的情况下，ssDNA探针FQ可以被切开，荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光差。由图6B可知，125、250、500、1 000 nmol/L LbCas12a蛋白组荧光值均极显著高于对照组(P<0.01)，说明ssDNA探针FQ中荧光基团被成功释放，纯化后的LbCas12a具有活性。

①A，LbCas12a反式切割活性示意图；B，LbCas12a切割活性检测。②与空白对照组(0 mmol/L LbCas12a)相比，**，差异极显著(P<0.01)①A,Schematic diagram of LbCas12a trans cutting activity;B,LbCas12a cutting activity detection.②Compared with control group (0 mmol/L LbCas12a),**,Extremely significant difference (P<0.01)图6 LbCas12a蛋白的反式切割活性分析Fig.6 Trans-activity analysis of LbCas12a protein

3 讨 论

近年来，随着新冠病毒SARS-Cov-2、PPV、非洲猪瘟等病毒的流行，人们迫切需要开发快速、简便、准确的病原鉴定技术。临床即时检验(point-of-care testing,POCT)技术应运而生，其核心组成成分是Cas12a蛋白家族。本研究将LbCas12a基因克隆至pET-28a(+)载体上，利用原核表达系统进行诱导表达，得到纯度较高、活性较强的LbCas12a蛋白，为后续基于LbCas12a蛋白的POCT应用提供了生物材料。

本研究中重组蛋白LbCas12a的大肠杆菌原核表达体系，具有操作简单、成本低廉、蛋白表达量高等优点[16]。在原核表达体系中，通常采用pET和pGEX表达载体[17]，前者所含标签为多组氨酸(6×His)，后者为谷胱甘肽转移酶(GST)。与GST-tag比较，His-tag约0.64 ku，其很少干扰目标蛋白的功能、活性和结构，且免疫原性较低[18-20]。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞缺乏Lon和OmpT蛋白酶，与T7 LacO启动子具有很高的亲和性[16]，能够有效避免重组蛋白降解，在本研究中pET载体中的LbCas12a蛋白充分被诱导表达。

将重组质粒pET28a-LbCas12a转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导蛋白表达，有研究认为，不同浓度的IPTG可能影响最终蛋白的产量[21]，但本研究中不同浓度IPTG对重组蛋白的表达效率影响不显著，说明IPTG浓度不是影响重组蛋白的表达效率的唯一因素，与黄孔威等[22]的结果基本一致。本研究进一步对诱导温度进行了优化，发现37 ℃时目的蛋白表达量高于30 ℃，可能原因是在30 ℃条件下，细菌生长速度变慢，重组蛋白的表达效率降低所致[23]。最后基于多组氨酸对镍离子(Ni2+)的螯合亲和力，本研究采用Ni-NTA树脂亲和层析柱方法进行纯化，用超滤方式浓缩，浓缩效果较好，为深入研究LbCas12a蛋白的功能提供条件。

多项研究表明，Cas12a的反式切割活性可以应用在核酸POCT检测中[11,24-27]。如果反应体系中存在靶标DNA如病毒核酸，LbCas12a/crRNA复合物靶向目标DNA形成三元复合物，从而激活LbCas12a的反式切割活性，将体系中与ssDNA偶联的荧光分子切下，释放荧光信号[28-29]。利用本研究中的LbCas12a蛋白对PPV进行检测，设计5′-端修饰荧光基团FAM和3′-端修饰淬灭基团BHQ的ssDNA荧光报告探针，当存在PPV核酸时，LbCas12a发挥作用，探针被切割，荧光基团与淬灭基团分离，检测到了释放的荧光信号，且在低浓度LbCas12a(125 nmol/L)的试验组荧光强度也显著高于对照组，与彭小唤[30]的结果相似，表明本研究纯化浓缩得到的LbCas12a蛋白具有生物活性，为畜牧业生产中POCT应用提供了重要的生物学工具。

4 结 论

本研究成功构建pET28a-LbCas12a重组质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达，确定了IPTG最佳诱导浓度为0.5 mmol/L、最佳诱导温度为37 ℃，且主要为可溶性表达。经分离纯化、超滤浓缩后得到分子量为143 ku的LbCas12a蛋白，浓度为485 ng/μL，具有反式切割活性。结果可为后续基于CRISPR/LbCas12a系统的POCT检测技术在畜牧业中的应用奠定了基础。