刘卫国 ,何利芳 ,顾 玲 ,何育威 ,侯俊杰△

（1.长江大学附属仙桃市第一人民医院甲状腺乳腺外科，仙桃 433000；2.湖北省黄石市中心医院甲状腺乳腺外科，黄石 435000）

乳腺癌是世界女性最常见恶性肿瘤之一，据流行病学资料显示，其在美国死亡率已经跃居第一位[1]，在中国，乳腺癌的发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势，严重威胁女性健康[2]。化疗是临床上针对乳腺癌治疗的常用手段，但由于患者的个体差异性，其对化疗药物的敏感性也各有不同，统一的化疗方案对不同的患者有着不同的疗效[3]。研究发现，与乳腺癌细胞增殖和凋亡相关的基因，如人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）、人抑癌基因p53 和促凋亡基因Bax等与患者化疗敏感性有关[4-5]。

淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，临床上主要用于乳房肿块和高血压等疾病的治疗。淫羊藿素（icaritin,ICT）是淫羊藿主要活性单体淫羊藿苷的水解产物，具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗氧化和免疫抑制等多重效应[6]。研究发现，ICT可逆转人多发性骨髓瘤耐药细胞株KM3/BTZ 的多药耐药性的作用[7]。脱水ICT 可抑制受体状态不同的人乳腺癌细胞株的增殖活性[8]。基于此，本研究通过构建乳腺癌顺铂（cisplatin，CDDP）耐药株，进一步探究ICT对乳腺癌化疗敏感性的影响及其可能的作用机制，为乳腺癌的临床治疗提供可靠的化疗增敏药物。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物和主要试剂 人三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中科院上海细胞库。ICT（货号：JOT-11573；纯度≥98%）购自成都普菲德生物公司；注射用CDDP（国药准字H37021358）购自齐鲁制药。MTT 购自美国Sigma 公司；PRMI-1640 购自美国HyClone 公司；Matrigel 购自美国的BD 公司；结晶紫购自北京碧云天公司；ECL购自武汉谷歌生物科技公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒购自美国的Invitrogen 公司；Transwell 小室购自美国Millipore公司。一抗磷酸化（p）-ERK1/2、p-p53及GAPDH购自美国CST公司。

1.2 细胞培养及MDA-MB-231/CDDP 耐药株的构建 取MDA-MB-231 细胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的不完全RPMI-1640 培养基培养，置于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。待细胞汇合度达到90%，加入100 ng/mL的CDDP，采用持续诱导法以100 ng/mL 浓度稳定增加药物浓度，使细胞稳定存活，传代。以4 μg/mL的维持浓度至少培养7 个月获得耐药CDDP 细胞株。实验前停用CDDP两周。

1.3 MTT 法检测MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞株增殖活性 取传代后对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞，消化，重悬细胞，并进行细胞计数，使细胞密度为5 000个/孔，将细胞接种至96 孔板中，设置对照组（0.0 μmol/L ICT）和不同浓度（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L、2.5 μmol/L、3.0 μmol/L、4.0 μmol/L、5.0 μmol/L）ICT处理组。待细胞贴壁后根据分组给予药物处理后继续培养48 h。采用MTT 检测细胞的增殖情况，检测波长为570 nm，计算细胞增殖率=处理组OD 值/对照组OD 值×100%。取对MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞增殖没有影响的临界浓度用于后续实验。

取对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞，消化、重悬后继续接种于96孔板，设置各浓度CDDP 组及CDDP+ICT 组，CDDP 处理MDA-MB-231 细胞的终浓度分别为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，处理MDA-MB-231/CDDP耐药细胞的终浓度分别为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL、6.0 μg/mL、7.0 μg/mL，ICT 浓度为上述临界浓度。待细胞贴壁后根据分组给予药物处理后继续培养至48 h。采用MTT 检测细胞的增殖情况，检测波长为570 nm，计算细胞相对增殖率=（实验组OD 值-对照组OD 值）/对照组OD值×100%。

1.4 Transwell 检测细胞侵袭 取100 μL Matrigel凝胶均匀铺在小室上层，然后将小室放在孔板内；取对数生长期MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞，PBS洗涤后换用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度约5×105个/mL；在小室上室加入200 μL 细胞悬液，设置对照（Con）组、CDDP 组及CDDP+ICT组，按照分组加入CDDP和ICT，使其终浓度分别为IC50和临界浓度，对照组加200 μL 细胞悬液。培养48 h后将Transwell小室取出，弃去培养基，酒精棉签擦去上层Matrigel 凝胶及未穿膜的细胞。另取干净的24孔板中，将小室置于其中，4%多聚甲醛固定30 min。弃去固定液，结晶紫染色10 min，PBS 洗涤，棉签擦去未结合的染料，显微镜下随机选取3个视野，计算穿膜细胞数量。相对侵袭率=实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数×100%。1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞，消化，重悬并调整其密度为1×105个/mL，接种于6 孔板。胰酶消化，离心，弃上清，加入结合缓冲液500 μL 对细胞进行重悬，再加5 μL AnnexinV-FITC 及5 μL PI 染液，混匀后避光孵育15 min，流式细胞仪分析检测各组细胞凋亡率。

1.6 Western blotting法检测p-ERK1/2和p-p53蛋白表达 于冰上裂解细胞，提取总蛋白；BCA 法测定蛋白浓度，配胶、上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PCDF膜，封闭；加入一抗p-ERK1/2、p-p53与内参蛋白GAPDH，4 ℃下孵育过夜；洗膜，加入二抗，室温下孵育2 h，洗膜；ECL 显色，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICT 对MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞CDDP敏感性的影响 随着ICT浓度的增加，其对乳腺癌细胞的增殖抑制作用更加明显，ICT表现出一定的抗肿瘤作用。当ICT浓度大于1.5 μmol/L时，ICT对MDA-MB-231细胞增殖有明显抑制作用（P＜0.001）；当ICT 浓度大于2 μmol/L 时，ICT 对MDA-MB-231/CDDP 耐药细胞增殖有显著的抑制作用（P＜0.05），见图1A。选择ICT 对两种乳腺癌细胞增殖无显著影响的浓度，即1.5 μmol/L 的ICT进行后续实验。

与CDDP 单独作用比较，ICT 联合CDDP 对两种乳腺癌细胞的增殖抑制作用更加明显（均P＜0.05），见图1B～1C。根据实验选取MDA-MB-231细胞的IC50浓度，即1 μg/mL CDDP进行后续实验。

图1 ICT对MDA-MB-231耐药细胞CDDP敏感性的影响

2.2 ICT 对MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞侵袭的影响 在两种乳腺癌细胞中，与Con组比较，CDDP单用和CDDP联合ICT均能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭（P＜0.05）；与CDDP单用比较，CDDP 联合ICT 抑制细胞侵袭的作用更加显著（P＜0.01），见图2。

图2 ICT对MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞侵袭的影响（×200）

2.3 ICT 对MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞凋亡的影响 在两种乳腺癌细胞中，与Con 组比较，CDDP 组和CDDP+ICT 组细胞凋亡更加明显（P＜0.001）；与CDDP 单用比较，CDDP 联合ICT 诱导两种细胞凋亡的作用更加显著（P＜0.001），见图3。

图3 ICT对MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞凋亡的影响

2.4 ICT 对MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐药细胞ERK1/2 和p53 蛋白表达的影响 与Con组比较，两种细胞的p-ERK1/2蛋白表达均显著降低（P＜0.001），p-p53蛋白表达显著升高（P＜0.05）；且CDDP联用ICT较CDDP单用对p-ERK1/2蛋白表达的下调及p-p53蛋白表达的上调作用更加明显（P＜0.05），见图4、表1。

图4 ICT对两种细胞p-ERK1/2和p-p53蛋白表达的影响

表1 3组p-ERK1/2和p-p53蛋白表达比较±s

表1 3组p-ERK1/2和p-p53蛋白表达比较±s

与Con组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CDDP组比较，*P＜0.05。

3 讨论

目前临床上针对乳腺癌的治疗已经有了较为明显的进展，但乳腺癌患者由于经常产生耐药情况且缺乏有效的药物治疗靶点，因此，乳腺癌患者面临着生存期较短，死亡率较高的危险[9]。CDDP为一种抑制DNA复制的烷化剂，属于非细胞周期特异性化疗药，其在三阴乳腺癌的临床治疗中具有重要地位[10]。但在乳腺癌的临床治疗上，随着化疗药物周期的延长，其也易产生耐药性，同时伴随着多种毒副作用的发生。因此，针对乳腺癌细胞对CDDP 的耐药，临床上也多采取多药联合的方式来治疗乳腺癌，寻求一种化疗增敏剂能够增强CDDP 化疗敏感性而降低其毒副作用的药物则显得至关重要[11-12]。蒋绍艳等[13]研究证实，淫羊藿苷可抑制人卵巢癌细胞的多药耐药，抑制耐药细胞株的增殖、侵袭及侵袭能力，同时，还可通过上调凋亡相关蛋白caspase-3的表达诱导细胞的凋亡。

本研究发现，相较于CDDP单独作用，ICT联合CDDP 对两种乳腺癌细胞的增殖抑制作用更加明显。根据实验选取MDA-MB-231 细胞的IC50浓度，继续探究ICT联合CDDP对两种细胞的侵袭和凋亡的影响。结果发现，在两种乳腺癌细胞中，相较于Con组，CDDP单用和CDDP联合ICT均能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭，诱导凋亡；但与CDDP 单用比较，CDDP 联合ICT 抑制细胞侵袭及诱导凋亡的作用更加明显。结果提示ICT可增强CDDP对乳腺癌细胞增殖和侵袭的抑制作用，且诱导细胞凋亡的作用更加显著。

有研究发现，铂类药物可通过p63/p73 相关通路影响三阴乳腺癌的化疗敏感性[14]。此外，p53 基因的突变也被证实与三阴乳腺癌较差的预后密切相关，许多化疗药物通过p53 依赖性细胞凋亡实现其作用。p53基因表达的下调可大大降低铂类药物的敏感性，其机制可能涉及到DNA 的损伤修复[15]。除p53基因外，ERK1/2通路的异常激活在乳腺癌的发生发展中也扮演着重要角色[16]，ERK1/2 MAPK是Ras 基因下游最为经典的一条信号通路，ERK1/2 MAPK 通路主要参与调控细胞周期以及促炎性细胞因子的表达，与许多肿瘤的发生发展密切相关[17-18]。研究表明，ICT 可激活包括PI3K/Akt、JAK/STAT3 和MAPK/ERK/JNK 在内的多种关键细胞信号通路发挥抗血液恶性肿瘤的作用[19]。Lu等[20]研究发现，ICT 还可通过靶向ERK 通路抑制A549 细胞的增殖和迁移等。本研究发现，相较于Con组，两种细胞的p-ERK1/2 蛋白表达均显著降低，p-p53 蛋白表达显著升高；且CDDP 联用ICT 较CDDP 单用对p-ERK1/2蛋白表达的下调及p-p53蛋白表达的上调作用更加明显。提示ICT对CDDP的增敏作用可能与ERK1/2 相关通路的抑制及p-p53 蛋白的激活有关。

综上，ICT 联合CDDP 较CDDP 单用对人乳腺癌细胞及其CDDP 耐药细胞株的增殖、侵袭抑制作用和凋亡诱导作用更加明显，且ICT 的增敏作用可能与ERK1/2 相关通路的抑制及p-p53 蛋白的激活有关。