周佳欣，邹文进

（广西医科大学第一附属医院眼科，南宁 530021）

角膜瘢痕是导致失明的主要原因[1-2]，多种眼科常见病均可能导致角膜瘢痕，包括角膜碱烧伤、感染、炎症、内眼手术等[3]，一旦角膜愈合过程形成永久性瘢痕，将会影响视力，患者可能需要进行角膜移植，但现在角膜供体非常紧缺，亟待一种可以抑制角膜瘢痕形成的药物。多西环素是一种常用的抗生素，具有良好的抗炎和抗感染作用[4]，近年来的研究发现，其还可以抑制肺纤维化[5]、心肌纤维化[6]、减轻皮肤瘢痕厚度[7]等，然而其是否可以抑制角膜瘢痕形成鲜有报道，其如何对瘢痕相关因子的产生作用更是尚未阐明。角膜瘢痕形成是涉及炎症细胞浸润，多种细胞因子、生长因子合成与分泌，上皮细胞再生，角膜细胞纤维化增生的复杂过程[8]；其中转化生长因子（TGF-β1）诱导的角膜细胞纤维化是重要因素。本研究通过TGF-β1 诱导角膜细胞分化成角膜肌成纤维细胞，观察多西环素对体外培养的角膜肌成纤维细胞Collagen Ⅰ和Fibronectin表达的抑制作用，并用大鼠构建角膜碱烧伤模型，观察多西环素对碱烧伤后形成的角膜瘢痕作用，从体内实验和体外实验验证其抑制角膜瘢痕形成，并探索其深入的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 DMEM/F12培养基、PBS、胎牛血清、青霉素—链霉素双抗（加拿大WISENT 公司）；0.05%胰酶（美国Sciencell 公司）；Ⅰ型胶原酶（美国Gibco 公司）；人重组转化生长因子TGF-β1（美国Peprotech 公司）；T25 细胞培养瓶（美国Corning 公司）；细胞培养箱（德国Binder 公司）；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测试剂盒（日本Takara 公司）；重组Anti-Vimentin 抗体、重组Anti-Keratin12 抗体（英国Abcam 公司）；羊抗兔IgG H&L、羊抗鼠IgG H &L（英国Abcam 公司）；DAPI、抗荧光淬灭的封片液（中国索莱宝公司）；各种规格移液枪（德国Eppendorf 公司）；多西环素粉末（美国Sigma 公司）；显微镜和荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 人角膜原代细胞的分离 收集飞秒激光微小切口基质透镜取出术（SMILE 术）中取出的角膜基质，放入装有无菌DMEM/F12 培养基的试管中，4 ℃低温运输，4 h 内转移至无菌工作台；用含有100 μL/mL 青霉素/链霉素的PBS 反复漂洗3 次，然后用眼科剪剪成小块后放入Ⅰ型胶原酶溶液，放置37 ℃环境中消化1 h；充分消化后，用200 目细胞过滤筛过滤溶液后，1 000 r/min 离心5 min，小心去除上清，然后往装有细胞沉淀的试管中加入适量的DMEM/F12 培养基（含有10%胎牛血清），混匀后计数种瓶，放入37 ℃、5%CO2浓度的培养箱，静置培养。

1.3 人角膜细胞的传代培养和鉴定 用倒置显微镜观察，原代细胞融合度达85%进行细胞传代，培养基改为DMEM/F12 培养基（含有5%胎牛血清），每2 d换液1次，如融合度到85%即进行传代。传到第3 代以后，随机抽取3 瓶将细胞种到12 孔板，1×104个/孔，当孔板内细胞融合度为60%～70%时，用PBS轻柔漂洗3次，每次5 min；加入1 mL孔4%多聚甲醛固定15 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；加入200 μL 孔0.1%tritonX 100 通透15 min；PBS 漂洗3 次后，加入500 μL/孔BSA 封闭30 min；小心吸去封闭液后，加入Anti-keratin（1∶50）和Anti-Vimentin（1∶500），4 ℃孵育过夜；第2天弃一抗，用PBS漂洗3 次；吸干PBS 加入对应的荧光二抗，羊抗兔IgG H&L（1∶2 000）和羊抗鼠IgG H&L（1∶3 000），避光孵育1 h，弃二抗后用PBS漂洗3次，加入DAPI避光孵育5 min，用PBS漂洗3次后加入抗荧光淬灭的封片液封片到荧光倒置显微镜观察并采集结果。

1.4 人角膜细胞纤维化模型制备和分组 将细胞分为3 组，对照组：正常细胞，不加入任何生长因子和药物；模型组：在细胞传代种瓶后，随即加入5 ng/mL TGF-β1；多西环素组：细胞传代并加入5 ng/mL TGF-β1 干预后2 h，往培养瓶中加入20 ng/mL 的多西环素溶液（以PBS 为溶液）。将各组细胞放置37 ℃、5%CO2浓度的培养箱中培养48 h。

1.5 RT-qPCR检测CollagenⅠ和Fibronectin mRNA表达水平 根据Takara 抽提总RNA 试剂盒9767 说明书提取细胞RNA；使用Nano drop 检测所提取到的RNA 质量，A260/A280 为1.8～2.0 之间，符合实验要求，将RNA 逆转录为cDNA 进行PCR反应。反应条件为：95 ℃30 s预变性；95 ℃3 s，60 ℃34 s，设40个循环，设置3个复孔。引物序列为：GAPDH：上游5’-AGATCCCTCCAAAATCAA-GTGG-3，下游5’-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3’；CollagenⅠ引物：上游5’-TTCTGCAACATGGAGACTGG-3’，下游5’-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3’；Fibronectin 引 物：上 游5’-ACTGAGACTCCGAGTCAGCC-3’；下游5’-TTCCAACGGCCTACAGAATT-3’。目的基因相对表达量采用2-ΔΔCT法计算。

1.6 Western blotting 检测CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表达水平 用含有PMSF的RIPA裂解细胞，提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定各组蛋白浓度后，进行SDS-PAGE 电泳,转膜，封闭液封闭1 h，分别使用相应的一抗Tubulin（1∶3 000），Fibronectin（1∶1 000）和Collagen I（1∶1 000）孵育过夜，二抗（Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody，1∶2 000）孵育1 h，使用ECL 法进行显影。用Image J 测量条带灰度值，计算相对蛋白表达量。

1.7 动物实验及分组 本研究选用180～220 g 健康雌性SD 大鼠，饲养在标准动物室条件下[温度：（24±1）℃；湿度：（50±5）%]，适应1 周。造模前，使用体视显微镜检查眼部情况，排除有眼前段疾病的大鼠；采用随机数字表法将大鼠分为对照组和多西环素组，每组18 只。模型制备：对大鼠左眼进行角膜碱烧伤造模，遵循以下步骤：首先，用异氟烷全身麻醉，盐酸丙美卡因滴眼液滴左眼表麻，然后用移液枪吸取2 μL 1 mol/L NaOH 溶液，滴到直径为2 mm 的滤纸上，将该滤纸放置在角膜中央60 s，造成Ⅲ级碱烧伤,最后使用足量生理盐水彻底冲洗干净眼表。冲洗完成后，可见角膜中央形成一圆形灰白色烧灼斑，呈磨玻璃状，角膜基质水肿，虹膜隐约可见。造模成功后，给予眼液滴眼，对照组用眼液溶媒（除不含多西环素，其余一样），多西环素组用3 000 ng/mL 多西环素眼液，每天滴眼4 次，直至观察期末。实验遵循国家实验动物管理保护条例。

1.8 大鼠角膜混浊度评分

大鼠造模成功后，每天给予眼药水滴眼时，观察角膜恢复情况，并于第3、第7、第14 天在体视显微镜下仔细观察眼前段情况，对角膜混浊度评分并采集照片，评分标准参照Holland 等[9]的标准：0 分：角膜透明无混浊；1 分：角膜轻度混浊,虹膜纹理可见；2分：角膜混浊较重,虹膜纹理不清；3分：角膜混浊进一步加重,但可见瞳孔；4分：角膜完全混浊,看不清瞳孔。

1.9 苏木精—伊红（HE）染色观察大鼠角膜结构变化

大鼠造模成功后，在第3、第7、第14 天随机处死大鼠，取下眼球，清洗干净后，放入4%多聚甲醛中固定，依次梯度酒精进行脱水，石蜡包埋，切片，烤片，HE 染色，中性树胶封片光学显微镜观察，选取目标区域进行拍照，分析。

1.10 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人角膜原代细胞鉴定

免疫荧光结果可见Vimentin（绿色荧光）、DAPI（蓝色荧光），未见Keratin（红色荧光），确定为角膜细胞，见图1。

图1 角膜细胞Vimentin和Keratin表达情况（免疫荧光，×100）

2.2 多西环素对TGF-β1 诱导的人角膜细胞纤维化抑制作用

与对照组比较，模型组Fibronectin、Collagen ImRNA及其蛋白表达均增高（P＜0.05）；与模型组比较，多西环素组Fibronectin、Collagen ImRNA 及其蛋白表达均降低（P＜0.05），见图2。

图2 各组Fibronectin和CollagenⅠ的mRNA及其蛋白表达情况

2.3 多西环素对大鼠角膜混浊度影响

角膜碱烧伤后第3天，两组大鼠虹膜纹理不清，瞳孔隐约可见，基质水肿，结膜充血，上皮缺损；第7天，两组大鼠角膜基质水肿均消退，对照组瞳孔不可见，周边有大量新生血管长入，多西环素组瞳孔可见，虹膜纹理不清，未见明显新生血管长入；第14天，对照组瞳孔隐约可见，虹膜纹理不清，周边新生血管长入，多西环素组，除了角膜右下方还有约1 mm×1 mm 大小的角膜斑翳外，整个角膜透亮，瞳孔、虹膜清晰可见，周边新生血管少，见图3。角膜碱烧伤后第7、第14 天多西环素组角膜混浊度评分均低于对照组（均P＜0.05），见表1。

表1 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点角膜混浊度评分±s

表1 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点角膜混浊度评分±s

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图3 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点角膜情况

2.4 HE染色观察大鼠角膜结构变化

角膜碱烧伤后第3 天，可见两组角膜上皮均有明显缺损，基质层大量炎症细胞浸润，接近上皮层处可见新生血管管腔。此外，对照组角膜基质结构较为紊乱；第7 天，两组上皮均开始重新生长，基质层炎症细胞和新生血管减少，而对照组上皮与基质连接疏松，基质结构依然十分紊乱，炎症细胞比多西环素组更多；第14天，两组角膜上皮修复，视野内无明显可见炎症细胞，对照组基质结构排列比多西环素组紊乱，见图4。

图4 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点HE染色图（×200）

3 讨论

眼化学性烧伤发生率占眼外伤的11.5%～22.1%，是造成角膜瘢痕的重要原因，而且碱性烧伤因碱能溶解脂肪和蛋白，渗入眼内，会造成眼内组织坏死[10-11]，后果非常严重。目前研究认为，异常的愈合反应将会诱发炎症因子和细胞因子变化，发生一系列异常的级联反应，引起角膜细胞分化为肌成纤维细胞[12]、晶状体蛋白生成减少、细胞外基质排列紊乱[13]，最终形成角膜瘢痕。本研究在大鼠角膜碱烧伤实验中发现，碱烧伤3天后，两组大鼠均角膜上皮缺损，结膜充血，HE染色可见角膜基质有大量炎症细胞浸润，胶原排列紊乱；碱烧伤7天后，多西环素组炎症细胞少于对照组，并且胶原排列比对照组整齐，提示多西环素可减轻炎症反应，调节细胞外基质紊乱；碱烧伤14 天后，多西环素组角膜整体透明度比对照组高，仅可见少量斑翳，表明多西环素可以减轻角膜碱烧伤后角膜混浊度。

角膜损伤以后TGF-β1 合成增加会诱导角膜细胞分化为肌成纤维细胞，并促进它增殖，诱导细胞外基质合成增加，是导致角膜纤维化的重要原因[14-16]，Fibronectin和Collagen I是角膜纤维化的重要基因和细胞外基质的重要成分[17-18]。因此，本研究在细胞培养基中加入TGF-β1 构建角膜瘢痕形成的体外模型；实验结果显示，TGF-β1能高效诱导Fibronectin和Collagen I表达，而多西环素可以下调Fibronectin和Collagen的表达。多西环素虽然目前作为抗生素使用，但研究发现它具有良好的抗炎作用，且能抑制细胞外基质的异常合成，重塑细胞外基质[19-21]。故推测多西环素通过抑制Fibronectin 异常增殖和CollagenⅠ异常沉积，恢复细胞外基质结构；减轻大鼠角膜碱烧伤后炎症反应，使胶原恢复正常排列，从而减轻角膜瘢痕。

综上所述，多西环素可以抑制人角膜细胞纤维化基因的表达，减轻大鼠角膜碱烧伤后角膜的混浊度，促进角膜上皮修复。本研究结果为多西环素用于临床治疗角膜碱烧伤提供了一定的理论基础和运用依据。