白硕秋，农晓琳，2.3.4△，张思琴，李佳芮

（1.广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院，南宁 530021；2.广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，南宁 530021；3.广西颅颌面畸形临床医学研究中心，南宁 530021；4.颌面外科疾病诊治研究重点实验室（广西高校重点实验室），南宁 530021）

2型糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌疾病，在全球范围有较高发病率[1]。有证据表明，2 型糖尿病患者往往伴随全身严重并发症，如肾脏疾病、心血管病变以及肝脏损伤等[2-3]。2 型糖尿病所导致的肝脏损伤以肝脏炎性反应、非酒精性脂肪肝和肝纤维化等较为常见[4-5]。

青蒿琥酯（artesunate，ART）来自中药青蒿（Artemisia annua L.），具有较强的药物功效，近些年被用于抗疟疾、抗炎、抗病毒以及抗肿瘤研究中[6-7]。有研究表明，ART通过抑制各种炎症信号通路和下游因子发挥抗炎效果[8-9]。本课题组前期研究显示，ART对2型糖尿病大鼠心血管、肾脏、脑组织及唾液腺等有保护作用，但ART对糖尿病大鼠肝脏的影响尚不清楚[10]。盐酸二甲双胍作为2型糖尿病治疗的常用药，其降糖作用已被很多研究所证实。本实验通过观察2 型糖尿病大鼠肝脏超微结构及形态学、纤维化变化，研究磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）、白细胞介素-6（IL-6）在各组大鼠肝脏组织中的表达情况，探讨ART、盐酸二甲双胍及二者联合用药对2型糖尿病大鼠的影响及其可能机制，从而探究是否有作为2 型糖尿病及其肝脏并发症治疗辅助用药的可能性，旨在为临床治疗2 型糖尿病肝脏病变提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取60 只SD 雄性大鼠，5～6 周龄，体重（175±25）g，在18～25 ℃下，保持通风良好，适应性喂养7 d。实验全程符合动物伦理委员会相关规定。

1.2 动物分组及构建模型 60只SD大鼠被随机分为正常对照组（NC组，n=12，普通饲料喂养）和模型组（n=48，高糖高脂饲料喂养）。喂养8周后，对模型组大鼠进行腹腔注射链脲佐菌素溶液（35 mg/kg，购于Sigma公司），注射后于第3、第7天分别测其空腹血糖，若两次检测结果血糖值均大于11.1 mmol/L，则造模成功[10]。随后将模型组随机分为2型糖尿病组（DM组）、ART干预组（ART组）、盐酸二甲双胍干预组（MET 组）、ART+盐酸二甲双胍联合用药干预组（ART+MET组），每组12只。对ART组采用ART注射液（50 mg/kg，购于桂林南药有限公司）灌胃，MET 组采用盐酸二甲双胍溶液（150 mg/kg，购于深圳海王药业有限公司）灌胃，ART+MET组采用ART注射液（50 mg/kg）+盐酸二甲双胍溶液（150 mg/kg）灌胃处理。NC 组及DM 组则给与同体积生理盐水灌胃，每日1次。

1.3 组织取材和处理 给药干预4周，每周测定各组大鼠体重及空腹血糖值，随后处死大鼠。迅速剖开腹腔取出大鼠肝脏，用干净刀片进行分割，切取规则小块肝组织，固定在2.5%戊二醛溶液中，用于电镜观察。切取部分组织置于RNA keeper中保存，用于mRNA表达检测。其余组织固定于4%多聚甲醛中，包埋切片，妥善保存，以备后续实验使用。实验过程中对实验动物的处置遵循国家实验动物管理保护条例。

1.4 透射电镜观察肝脏的超微结构改变 将固定在2.5%戊二醛溶液中的肝组织置于4 ℃冰箱过夜，第2天取出固定好的肝脏组织进行脱水、包埋、双重染色处理，透射电镜下观察并拍摄。

1.5 苏木精—伊红（HE）和Masson 染色法分别观察肝脏组织形态学和纤维化改变 取肝脏石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度酒精水化（100%→95%→85%→75%），苏木精胞核染色，伊红细胞质染色，干燥，封片。另取一批切片，使用Masson 染色试剂盒（购于北京索莱宝有限公司）按步骤染色。在显微镜下分别观察肝脏组织形态学改变及纤维化程度并拍摄。

1.6 免疫组织化学染色法检测肝脏组织p-p38 MAPK、IL-6 蛋白表达 将石蜡切片进行脱蜡，水化，抗原修复，过氧化氢阻断，山羊血清封闭，随后分别加入p-p38MAPK、IL-6一抗（稀释倍数1∶200，购于Biorbyt公司），4 ℃冰箱过夜。第2天滴加二抗（稀释倍数1∶1 000，购于博士德公司），DAB 显色，苏木精复染，干燥，封片，观察拍摄。用Image-Pro Plus6.0软件计算p-p38MAPK、IL-6阳性表达的平均光密度值（MOD）。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测肝脏组织p-p38 MAPK、IL-6mRNA表达 取出RNA keeper 中的肝脏组织，充分研磨，Trizol 法提取各组肝脏组织中的总RNA，测定浓度及纯度。随后使用逆转录试剂盒（购于Thermo 公司）进行cDNA合成。以GAPDH作为内参基因，设计引物序列如下，GAPDH，上游：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；IL-6，上游：5’-ATTGTATGAACAGCGATGATGCAC-3’，下游：5’-CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3’；p-p38MAPK，上游：5’-CAGCTTCAGCAGATTATGCGT-3’，下游：5’-AGCCACTGGTTCATCGTCAG-3’。RT-qPCR 反应条件：预变性94 ℃30 s；变 性94 ℃5 s，退火、延伸60 ℃34 s，共40个循环。采用2-△△CT方法分别计算p-p38 MAPK、IL-6mRNA相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各组实验数据进行方差齐性检验，符合方差齐条件后，采用单因素方差分析的方法进行多组比较，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重及血糖水平比较 用药干预后，NC 组大鼠体重呈缓慢升高，空腹血糖值轻微波动。与NC组相比，DM组大鼠体重随时间推移逐渐降低，且下降较为明显，而空腹血糖值呈逐渐上升的趋势；与DM组相比，各治疗组大鼠空腹血糖值随时间推移均有不同程度降低，而体重均有不同程度的上升，见图1a～b。干预第4 周末，与DM 组相比，ART 组、MET 组、ART+MET 组大鼠空腹血糖值下降，体重升高（均P＜0.05），见图1c～d。其中，ART+MET组大鼠空腹血糖值下降接近正常水平。

图1 各组大鼠体重及血糖水平比较

2.2 各组大鼠肝脏组织超微结构比较 透射电镜下，NC 组大鼠肝细胞结构清晰，细胞核圆而规则，核仁均匀；细胞质可见丰富的线粒体、内质网等细胞器。DM组可见核膜增厚，胞核变形；线粒体及内质网出现肿胀，变形；细胞内见大量脂滴。ART组、MET组和ART+MET组线粒体损伤程度减轻，肿胀变形情况减少，内质网扩张程度较DM组轻，脂滴较DM组少，其中以ART+MET组改善最明显，见图2。

图2 各组大鼠肝脏组织透射电镜结果（×15 000）

2.3 各组大鼠肝脏组织形态学及纤维化比较 光镜下，NC组大鼠肝脏可见清楚肝小叶结构，肝细胞呈辐射状排列，形态大小正常，未见明显炎症细胞浸润及脂肪变性；DM组大鼠肝脏细胞肿胀变形，可见肝窦淤血及广泛脂肪变性，炎性细胞浸润，部分可见坏死灶；ART 组、MET 组和ART+MET 组大鼠肝细胞脂肪变性程度及炎症细胞浸润情况较DM组均有所减轻，ART+MET组改善更为显著。NC组大鼠中央静脉见少量蓝色胶原纤维，DM 组大鼠肝组织胶原纤维增多增粗，多处形成不完全纤维间隔，细胞间也可见胶原纤维；与DM 组相比，ART 组、MET组和ART+MET组蓝色胶原纤维均有所减少，见图3。

图3 各组大鼠肝脏组织HE、Masson染色结果（×400）

2.4 各组大鼠肝脏组织p-p38MAPK，IL-6 蛋白表达比较 p-p38MAPK表达呈较强的胞核染色，IL-6表达呈较强的细胞质染色，均表现为棕黄颗粒。与NC 组相比，DM 组p-p38MAPK、IL-6 蛋白表达均升高（均P＜0.01）；与DM 组相比，ART 组、MET 组及ART+MET组中p-p38 MAPK、IL-6蛋白表达均降低（均P＜0.05）；ART+MET组IL-6的表达低于ART组与MET组（均P＜0.05），见图4。

图4 各组大鼠肝脏组织免疫组织化学法染色结果及p-p38MAPK、IL-6蛋白表达量比较（×400）

2.5 各组大鼠肝脏组织p38MAPK、IL-6mRNA 相对表达量比较 与NC 组相比，DM 组大鼠pp38MAPK、IL-6mRNA 相对表达量升高（P＜0.01），与DM 组相比，ART 组、MET 组及ART+MET 组中p-p38MAPK、IL-6mRNA相对表达量均下降（均P＜0.01），其中，ART+MET 组中p-p38MAPKmRNA 相对表达量的下降较ART 组、MET 组更为显著（P＜0.05），见图5。

图5 各组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、IL-6 mRNA相对表达量比较

3 讨论

有研究证明，链脲佐菌素可导致胰岛素缺乏和高血糖，从而经过一系列反应产生肝脏损害[11-12]。其构建的2型糖尿病大鼠可模仿人类糖尿病患者的生化、血液指标变化以及各项相关并发症[13]。因此，本实验选用注射链脲佐菌素来建立2型糖尿病大鼠模型。课题组前期研究发现，使用浓度为50 mg/kg ART 注射液灌胃降糖效果较好，明显优于其他浓度[10]，故本实验采用此浓度ART注射液进行灌胃干预。

通过对各组大鼠体重及空腹血糖值的测量，发现ART、MET 以及ART+MET 联合用药可缓解2 型糖尿病引发的体重减轻，且均有一定降糖作用，其中ART+MET 联合用药效果最为明显。通过HE 染色和Masson 染色发现，DM 组大鼠肝脏细胞变形，出现广泛脂肪变性，中央静脉扩张充血明显，可见炎性细胞浸润；胶原纤维增多增粗，形成纤维间隔；电镜下肝细胞中大量细胞器受损。在分别采用ART、MET 以及ART+MET 联合用药后，大鼠肝脏细胞脂肪变性、炎性反应、纤维化及超微结构各类细胞器均有所改善。说明2型糖尿病大鼠肝脏受损表现在脂肪变性、炎症反应及纤维化程度加重。而ART、MET 以及ART+MET 联合用药在一定程度上可以改善糖尿病大鼠的肝脏损伤，减轻糖尿病大鼠肝脏脂肪变性及纤维化程度。为进一步研究其可能的机制，本实验对各组大鼠肝脏组织中的pp38MAPK及IL-6的蛋白及mRNA相对表达量进行了分析。

p38MAPK 在肝脏脂质代谢、葡萄糖代谢及肝纤维化进程中起重要作用[14-17]。受外界刺激后，p38MAPK 被磷酸化激活，由细胞质转移至细胞核中，可诱导IL-6 等炎性因子的表达，参与肝脏免疫应答反应，导致肝脏损伤[18-19]。而炎性因子的产生又可导致进一步p38MAPK 活化，使各类细胞反应加剧，产生级联反应，加重靶器官损害。反之，抑制p38MAPK 通路磷酸化可促进体内葡萄糖代谢，减少脂肪合成，减轻炎症反应，缓解纤维化进程[20-22]。

本结果显示，与DM 组相比，ART、MET 以及ART+MET 联合用药干预组大鼠肝脏组织中pp38MAPK、IL-6 蛋白及mRNA 表达下调，其中ART+MET联合用药可使IL-6水平降低接近正常水平。说明2 型糖尿病大鼠肝脏受损与p38MAPK 被磷酸化激活，以及下游炎性因子IL-6的表达增多有关，而ART 可通过抑制p38MAPK 磷酸化及IL-6 的表达，减轻肝脏炎症反应及纤维化，从而发挥保护大鼠肝脏的作用，ART+MET 联合用药抑制此通路效果更好。

综上所述，ART 可缓解2 型糖尿病大鼠肝脏炎性反应，改善肝纤维化，且ART+MET联合用药效果更为显著，其机制可能与抑制p38MAPK/IL-6 信号通路的表达有关。ART 具有抗炎及改善纤维化作用，为临床上改善2 型糖尿病肝损伤提供新思路。同时，本研究对于纤维化及炎症相关通路的探索比较局限，尚待进一步的研究。