谭伟芬 付少萍

摘要：结核分枝杆菌感染内科最常见的感染性疾病，该感染会侵犯全身各器官，其中以肺结核最为常见，随着近年来医疗检验技术的进步，结核分枝杆菌感染的实验室诊断及检测技术不断优化，为疾病早期大规模快速检测带来极大便利。鉴于此，文章就近两年所发表的结核分枝杆菌感染的实验室诊断方法及检测技术文献结合我院实际治疗开展情况做如下总结。

关键词：结核分枝杆菌感染;实验室诊断;检测技术;研究进展

【中图分类号】 R730.43 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）10--01

结核分枝杆菌感染引起的结核病是全球范围流行的疾病，临床数据显示结核病是世界十大死亡原因之一，WHO数据显示目前全球范围内结核病患者数量约为2000万人，因此结核分枝杆菌感染的诊疗一直是临床研究的重要方向[1]。随着近年来医疗检验技术的进步及对疾病研究的深入，结核分枝杆菌感染的实验室诊断方法及检测技术已逐渐成熟，涂片镜检、免疫血清学检查、培养法、分子生物学检测等检查技术开始广泛应用并在实际应用中发挥着较为理想的诊断效果。本文就目前我国临床对于结核分枝杆菌感染实施的实验室诊断方法及检测技术开展情况做以下综述，现报道如下：

1.涂片镜检技术

涂片镜检技术在生物学及免疫学基础上建立的检测技术，包括萋-尼氏抗酸染色和荧光染色镜检，后者的敏感度优于前者。但该技术在实际应用中尚存在一定缺陷，原因在于肺结核患者中约40%-60%为菌阴肺结核，应用涂片镜检技术抗酸染色的阳性率相对较低，因此该技术往往无法有效探查菌落;另外该技术检查结核分枝杆菌感染敏感度相对较低，通常需要平均每毫升5000-10000条抗酸菌才可得出阳性结果[2]。

2.细菌培养法

分枝杆菌培养和菌种鉴定是目前临床针对结核分枝杆菌感染最精确可靠的检查，已成为该细菌感染疾病诊断的“金标准”，其中固定培养法是指以鸡蛋为基础，在高温凝固形成的两个培养基中实施分枝杆菌培养，一般可在2-3周内出现细菌生长;液体培养法的优势在于液体培养基内营养丰富，细菌可在液体中于营养物质充分接触，因此该技术能有效缩短培养时间，正常情况下可在1-2周内出现细菌生长。

3.血清学检查

血清学检查是结核分枝杆菌感染重要的辅助检查方法，该检查具有推广难度小、操作简便、无需精密仪器等优点。随着近年来检测技术的进步，血清学检查结核分枝杆菌感染受到广泛重视、联合应用结核抗原、酶联免疫斑点技术、蛋白芯片技术开始逐渐推广应用。其中酶联免疫斑点技术是上述疾病实验室诊断及检测技术发展最为迅速的部分，该技术的原理是抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞予以酶联斑点显色方式表达。

目前临床上最常用的方法为IGRAs，基本原理是MTB感染者体内致敏的T淋巴细胞，在体外再次接受MTB特异性抗原刺激后，激活的效应T淋巴细胞能够产生特异性IFN-γ，通过对IFN-γ的检测判断是否存在MTB感染。根据检测技术和操作程序的不同，IGRAs方法有2类：（1）以基于酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测全血中MTB特异性抗原刺激后释放的IFN-γ水平;（2）采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测在MTB特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中释放IFN-γ的效应T淋巴细胞数目。

4.结核菌素皮肤试验

结核菌素皮肤试验又被称为PDD皮肤实验，该技术主要采用结核分枝杆菌的纯蛋白衍生物实施前臂内侧皮肤注射，再通过观察受检者局部皮肤是否出现红肿硬结，但由于我国国民大多接种了卡介苗，故单纯依靠结核菌素皮肤试验或难以判断是自然感染或卡介苗的免疫应答反应，并受患者免疫状态及部分非结核分枝杆菌感染的影响可能出现假阴性或假阳性，在实际应用中需综合使用其他检查，以此提升诊断效力。

5.分子生物学检测

PCR检查主要利用体外扩增技术检查结核分枝杆菌，是目前临床针对结核分枝杆菌感染应用率最高的基因检查技术。（1）GeneXpert结核分枝杆菌（MTB）技术是由美国Cepheid公司研发的一套半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术。以利福平耐药基因rpoB基因为靶向基因，可在2h内同时检测MTB和对利福平是否耐药。该方法于2010年由WHO推荐用于肺结核的诊断，2013年WHO又推荐其用于肺外结核的诊断。目前GeneXpert结核分枝杆菌（MTB）技术广泛应用于临床，成为诊断结核病重要的检测手段，大大地提高了病原学阳性率，初步判断患者耐药情况，指导临床抗结核治疗方案。该检查具有更高的简便性及特异性，能最大限度避免交叉感染，进而提升诊断的精准度。而Xpert MTB/RIF Ultra是新一代检测技术，靶基因增加了IS6110和IS1081，其敏感度优于Xpert MTB/RIF。（2）交叉引物扩增技术（cross-priming amplification，CPA）：采用IS6110基因为靶基因。在成人结核病检测的敏感度为72%。WHO于2018年在全球结核病报告中介绍了该方法，认为其可作为Xpert MTB/RIF的替代方法，在结核病的诊断中具有潜在价值。（3）分子线性探针测定法：该技术主要利用核酸扩增和反向杂交技术，将不同靶基因的特异性探针置于纸条上，进行一系列的反应。该方法可以鉴别MTBC和NTM，并进行耐药相关基因检测，敏感度（92.9%）和特异度（99.3%）高;WHO推荐GenoTypeMTBDR为MDR-TB的快速诊断方法[4]。

高通量测序技术：采用高通量测序平台对临床标本或阳性培养物中的核酸进行靶向测序或全基因组测序，通过将测序数据与数据库序列比对明确是否存在MTB特异性序列，获得MTB的耐药基因突变情况，从而进行诊断和/或耐药性预测。WHO在2018年的技术指南中指出，高通量测序技术可以作为检测耐药结核病的病原学新方法，并建议在有条件的地區予以推广。其局限性为检测步骤复杂，周期较长，费用高;检测结果易受人源宿主及环境物种遗传物质的干扰。近年来快速发展的宏基因检测技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，一代宏基因检测只能测量单一的序列，最长可测得1000-1500bp;二代宏基因检测能测得大量序列，但片段被限制在250-300bp;三代宏基因检测能测最长可测得10kb[5]。

6.病理学检查

典型的病变由融合的上皮样细胞结节组成，中心为干酪样坏死，周边可见朗格汉斯巨细胞，外层为淋巴细胞浸润和增生的纤维结缔组织[6]。主要病理变化包括渗出性病变、增生性病变和坏死性病变，这3种病理变化常混杂存在，并相互转化。组织病理学检查对于结核病有确诊价值，但若病理改变中未找到MTB，需要结合临床和影像学特点以除外真菌感染等疾病引起的肉芽肿改变。病理组织的获取方法：肺组织、胸内淋巴结可通过内镜检查、外科手术、尸检时获得。病理结果阳性判定：（1）组织形态学符合结核病病理基本变化;（2）病理分子生物学鉴定为MTB[7]。

7.小结

随着现代医疗检验技术的进步，结核分枝杆菌感染的实验室诊断方法及检测技术越发成熟，涂片镜检技术、分子生物学检测、细菌培养法、血清学检查、结核菌素皮肤试验在其中发挥着重要作用，但各项检测手段实施需根据临床实际情况进行选用，后续研究需在联合运用各项检测手段的前提下为患者提供最具效力的病理诊断，最大限度提升结核分枝杆菌感染的诊断精确率及诊断效率。

参考文献：

[1]王智慧，梁亚充，王玉红，等.结核分枝杆菌/利福平耐药基因联合结核感染T细胞斑点检测在耐药结核性胸膜炎中的应用价值[J].中国热带医学，2021，21（2）：112-116.

[2]中国防痨协会.高危人群结核分枝杆菌潜伏感染检测及预防性治疗专家共识[J].中国防痨杂志，2021，43（9）：874-878.

[3]曾海清，熊君晖，温顺华，等.结核分枝杆菌相关检测试剂盒对结核分枝杆菌感染的诊断价值研究[J].国际检验医学杂志，2019，40（12）：1493-1497.

[4]钟明浩，黄裕春，关海舰，等.4种结核分枝杆菌潜伏感染检测方法的比较[J].广东药科大学学报，2021，37（5）：128-132.

[5]王度，方心俞，吴百健，等.宏基因组二代测序技术在非结核分枝杆菌骨关节感染诊断中应用价值的初步报道[J].中华创伤骨科杂志，2021，23（7）：577-582.

[6]樂晓琴，陈军，沈银忠，等.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术诊断艾滋病患者肺结核的临床应用评价[J].中华传染病杂志，2021，39（1）：21-24.

[7]王新刚，卫建民，杨俊松，等.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术在脊柱结核检测中的应用[J].颈腰痛杂志，2021，42（6）：875-877.