肖永学，刘 克

(1.胶南市灵山卫中心卫生院，山东 胶南 266427;2.青岛市城阳区第二人民医院，青岛 266112)

目前，常用抗肿瘤药多为化学合成的细胞毒类药物，对正常细胞和癌细胞选择性差，抑制骨髓造血系统，使白细胞数下降，导致肿瘤患者免疫力下降。牛磺酸(Tau)是一种含硫氨基酸，它对维持机体免疫系统的功能有非常重要的作用，是很好的免疫佐剂。本研究以S180荷瘤小鼠为模型，采用牛磺酸与环磷酰胺CTX联合用药，观察牛磺酸对环磷酰胺是否具有增效减毒作用。

1 实验材料

1.1 动物 昆明种小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，由山东省青岛市药品检验所提供。

1.2 瘤株 小鼠肉瘤细胞株(S180)由中国协和医科大学赠送，本室以腹水传代保种。

1.3 试剂 脂多糖，Sigma公司;刀豆蛋白A，Sigma公司;PRMI－1640培养基，Gibco生物公司;牛磺酸，天津市瑞金特化学品有限公司，批号:津Q/HX0016－2005;环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:06043021;白细胞分离液，上海华精生物高科技有限公司，批号:060912。

1.4 仪器 离心机;恒温水浴锅;多功能显微镜(日本，O-lympus公司);二氧化碳培养箱(德国赫利公司);酶标仪(美国BIO－RAD);无菌超净台(苏州安泰空气技术有公司);电子分析天平(上海天平仪器总厂)。

2 实验方法

2.1 药物配制 牛磺酸为白色结晶粉末，溶于水，实验前用生理盐水配制成所需浓度溶液;环磷酰胺实验前用生理盐水配制成所需浓度溶液。

2.2 S180荷瘤小鼠模型的建立［7～9］选择本室腹水型传代7～10 d且健康状况良好的S180荷瘤小鼠，腹部皮肤用碘酊、酒精消毒后，抽取腹水，血细胞计数板上台盼蓝染色法证实活细胞率95%以上。以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，浓度为1×107个·mL－1。小鼠右腋窝皮下接种0.2mL(含瘤细胞2×106)S180细胞悬液。

2.3 动物分组及给药 接种肿瘤后，将S180荷瘤小鼠随机分为5组:模型组，CTX组，CTX+Tau低、中、高剂量组，每组10只。CTX组:给予CTX 20mg·kg－1;模型组:给予生理盐水0.2mL;CTX+Tau低、中、高剂量组:分别给予 CTX 20mg·kg－1，Tau 50、100、200mg·kg－1。各组小鼠均于接种肿瘤 24 h后分别腹腔注射给药，每日1次，连续8 d。常规饲养，饮水、食物不限。

2.4 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用各组小鼠均于接种肿瘤细胞24 h后分别腹腔注射给药，每日1次，连续8 d，常规饲养，饮水、食物不限。第8天停止给药和注射生理盐水，24 h后，各组小鼠称重，颈椎脱臼处死，剥取瘤块，除去脂肪纤维组织称重，按下列公式计算肿瘤抑制率(%):抑瘤率=(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

2.5 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠外周血白细胞数［10］和骨髓有核细胞数的影响 给药24 h后断尾取血，进行白细胞计数。于小试管中加入白细胞稀释液0.38mL，然后用血红蛋白吸管自断尾处取0.02mL血液，立即吹入稀释液中，并将吸管壁的血吸入稀释液内，轻轻摇匀，用小滴管自摇匀的稀释液中吸取少量液体加入血细胞计数池内，静置1～2min，在显微镜下观察并计算白细胞总数。在低倍镜下，白细胞呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特点可与杂质相区别。计数计数池四角的4个大方格中所有的白细胞数，将总数乘以50，即得每毫升血中白细胞数。小鼠颈椎脱臼处死，剥离右侧股骨，用1640培养液通过针头反复冲洗骨髓并测定洗液中骨髓有核细胞数。

2.6 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠免疫器官指数的影响 末次给药24 h后颈椎脱臼处死小鼠，无菌取胸腺和脾，用电子分析天平分别称重。根据以下公式计算胸腺指数、脾指数:胸腺指数(thymus index，TI)=胸腺重(g)/体重(g);脾脏指数(spleen index，PI)=脾重(g)/体重(g)。

2.7 S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性测定和淋巴细胞增殖活性测定

2.7.1 S180荷瘤小鼠脾细胞悬液制备 无菌摘除脾脏，剔除结缔组织，PBS冲洗1次，200目不锈钢筛网上，把脾脏用研钵碾碎，筛网下置安剖，用PBS反复冲洗于高压灭菌安瓿中。所得混入脾细胞的液体加入到含有白细胞分离液的离心管中，离心，得到脾细胞悬液。反复冲洗数次，制成单个脾淋巴细胞悬液。台盼蓝染色计数，活细胞95%以上，调整浓度5×106个·mL－1。

2.7.2 S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性测定 MTT比色法。取脾细胞悬液，浓度为5×106个·L－1，作为效应细胞(E)。制备常规培养S180细胞悬液(活性＞95%)，浓度为1×105个·L－1，作为靶细胞(T)。效靶细胞浓度比为50∶1。每只鼠设靶细胞孔(T)，效应细胞孔(E)，效应细胞+靶细胞实验孔(E+T)，另设空白对照孔。按表1加样于96孔圆底培养板，每孔终体积200μL。每样本设3个复孔。将培养板移入CO2培养箱，37℃ 5%CO2饱和湿度条件下孵育24 h后，各孔加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL同样条件继续孵育4h后终止培养。然后吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均匀，于酶标仪490 nm处测定OD值。计算方法:NK细胞活性(%)=［靶细胞对照孔OD值－(实验孔OD值－效应细胞对照孔OD值)］/靶细胞对照孔OD值×100%。加样见表1。

2.7.3 S180荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖活性测定 取脾细胞悬液，浓度为5×106个·L－1，ConA溶液浓度调整为5mg·L－1。每只鼠设:ConA实验孔，空白对照孔。按表2加样于96孔平底培养板，每孔终体积200μL。每样本设3个复孔。将培养板移入CO2培养箱孵育72 h后，加入MTT溶液(5mg·mL－1)20μL，同样条件继续孵育4 h后终止培养。然后弃上清液，每孔加入150μL DMSO。吹打均于酶标仪570 nm波长处测定OD值，计算淋巴细胞增殖率。淋巴细胞增殖率(%)=［(实验孔OD值－对照孔OD值)/对照孔OD值］×100%。加样见表2。

表1 测定NK细胞活性各组加样情况

表2 测定T淋巴细胞增殖活性测定各组加样情况

S180荷瘤小鼠B淋巴细胞增殖活性测定:方法同T淋巴细胞，丝裂原为 20mg·L－1的 LPS。

3 实验结果

3.1 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用与模型组比较，CTX组与Tau+CTX各剂量组都具有显著的肿瘤抑制作用。并且Tau+CTX低、中、高剂量组抑瘤率均高于CTX组，并呈现一定的量效关系。说明Tau可以协同CTX发挥抑制肿瘤的作用，结果见表3。

3.2 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠外周血白细胞数和骨髓有核细胞数的影响:CTX组外周血白细胞数量与模型对照组比较显著降低，CTX+Tau中、高剂量组外周血白细胞数量与CTX组比较，明显升高;CTX组骨髓有核细胞数量与模型对照组比较显著降低，CTX+Tau中、高剂量组骨髓有核细胞数量与CTX组比较，明显升高。说明Tau可以减轻CTX抑制荷瘤小鼠骨髓的毒性，提高荷瘤小鼠CTX化疗后外周血白细胞数，结果见表4。

表3 Tau与CTX合用对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

表4 Tau与CTX合用对S180荷瘤小鼠外周血白细胞数和骨髓有核细胞数的影响

3.3 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠免疫器官指数的影 与模型组比较，CTX组荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数均显著降低(P＜0.05);而CTX+Tau各剂量组高于CTX组(P＜0.05)，尤其是CTX+Tau高剂量组(P ＜0.01)，说明CTX对S180荷瘤小鼠的免疫器官具有免疫毒性，而Tau可以抑制CTX的这种作用，并且呈剂量依赖性。说明牛磺酸可以促进荷瘤小鼠脾脏和胸腺的生长，改善CTX对荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，结果见表5。

3.4 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响 CTX组NK细胞活性与模型组比较，两者之间没有差异，但是CTX+Tau高剂量组NK细胞活性与CTX组比较，明显升高，差异有显著性，结果见表6。

3.5 牛磺酸与环磷酰胺合用对S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖活性的影响 与模型组比较，CTX组T、B淋巴细胞增殖没有明显差别;与CTX组比较，CTX+Tau低、中、高剂量组T淋巴细胞增殖活性升高，并且低、中、高剂量组B淋巴细胞增殖活性均上升，结果见表7。

表5 Tau与CTX合用对S180荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

4 结论

本研究采用S180小鼠移植瘤模型，以化疗药物CTX作阳性对照组，观察Tau对CTX的增效减毒作用。通过本实验得到如下结论:

表6 Tau与CTX合用对S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响

表7 Tau与CTX合用对S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖活性的影响

①Tau合用CTX，对S180荷瘤小鼠抑瘤率明显高于单一使用CTX，Tau与CTX合用对肿瘤具有协同抑制作用;②Tau改善了CTX对S180荷瘤小鼠骨髓的抑制作用，Tau与CTX合用可明显升高外周血白细胞数和骨髓有核细胞数;③Tau可以减轻CTX对S180荷瘤小鼠免疫器官的毒性作用，保护S180荷瘤小鼠脾脏和胸腺并促进其生长;④Tau与CTX合用可以增强S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性;⑤Tau与CTX合用可以增强S180荷瘤小鼠的淋巴细胞增殖率。

综上所述，Tau与CTX合用对肿瘤具有协同抑制作用，改善CTX对小鼠骨髓的抑制作用，缓解CTX对机体的免疫毒性作用，即Tau对CTX具有增效减毒作用。

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