王英英，武彬蔚，李 莉*

(1.青岛市中医医院(市海慈医院) 输血科，山东 青岛266033；2.青岛市市立医院 检验科，山东 青岛266011)

肺炎克雷伯菌(KP)是医院内常见的条件致病菌，依据其黏液性可将KP分为经典的KP(cKP)和高黏液性KP(hvKP)。hvKP可引起肝脓肿、肺炎、菌血症、脑膜炎等多种疾病，其致死率达3%-32%[1-2]。近年来，hvKP的分离率有逐年增高的趋势，可高达30%-50%[3]。由于hvKP的高分离率和致死率，已成为全球公共卫生领域关注的焦点。本研究对临床分离的hvKP的标本来源、临床分布以及毒力基因的携带情况进行总结分析，旨在为临床因hvKP引起的感染的诊治及防控提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源收集 2019年1月-2020年12月，青岛市中医医院住院患者各种感染性标本中分离的KP 631株。细菌鉴定及药敏试验采用VITEK 2-compact全自动细菌鉴定/药敏系统进行测定，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。分离到的KP通过拉丝试验进行分类，即使用接种环在分离KP的血琼脂平板上，向上挑起单个菌落，若有黏液丝形成且长度≥5 mm，则判定为阳性，若无黏液丝形成或其长度<5 mm，则为阴性。将筛选的hvKP存于-80℃低温冰箱备用。

1.2 毒力基因及荚膜血清型检测用煮沸法提取待检菌株的DNA，采用PCR方法参照文献[4]检测6种毒力基因(magA、rmpA、rmpA2、kfu、iroNB、aerobactin)及常见的荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57)。

1.3 多位点序列分型选取KP的7个管家基因，管家基因引物序列由MLST网站提供(肺炎克雷伯菌：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，通过PCR扩增7个管家基因，将扩增产物进行测序并于网站比对，可根据各管家基因亚型即可最终得到MLST分型。管家基因引物序列见表1，PCR反应体系见表2。

表1 肺炎克雷伯菌管家基因引物序列及相关信息

表2 MLST管家基因PCR 反应体系

1.4 统计学方法采用WHONET 5.6软件进行细菌及药敏统计，药敏结果比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 hvKP的检出率在631株KP中共检出hvKP 56株，检出率为8.9%。

2.2 hvKP的标本来源和临床分布56株hvKP的标本来源为：穿刺液17株(30.4%)、血液12株(21.4%)、脓液11株(19.6%)、痰液6株(10.7%)、尿液3株(5.4%)，其他标本7株(12.5%)。其科室分布为：急诊病房12株(21.4%)、肝胆外科病房8株(14.3%)、呼吸科病房7株(12.5%)、普外科病房6株(10.7%)、神经外科病房5株(8.9%)、神经内科病房5株(8.9%)、内分泌科病房5株(8.9%)，其他病房8株(14.3%)。

2.3 药敏结果hvKP对大多数临床常用抗菌药物具有较高的敏感性，其耐药率明显低于cKP，见表3。

表3 hvKP和cKP对临床常用抗菌药物的耐药率(%)

2.4 荚膜血清型及毒力基因检测结果56株hvKP共检出K1型23株、K2型16株、K5型4株、K57型6株、K54型5株，分别占41.1%、28.6%、7.1%、10.7%和8.9%，未检出K20型，还有2株未分型。毒力基因主要以aerobactin和rmpA的携带率最高，分别为87.5%和78.6%，rmpA2、iiroNB、kfu和magA的携带率分别为58.9%、48.2%、39.3%和10.7%。

2.5 MLST分型结果MLST分型的主要流行株是ST23，占25.0%，其次为ST86、ST11、S651，分别占12.5%、10.7%和8.9%，其他型别均小于5%。

2.6 hvKP管家基因的PCR扩增产物电泳结果见图1。

图1 肺炎克雷伯菌管家基因的PCR扩增产物电泳

3 讨论

自1986年在我国台湾省首先发现1例hvKP以来[5]，相继在很多国家和地区对hvKP所引起的感染性疾病进行研究和报道，hvKP不仅可导致免疫力低下人群的感染，甚至还会引起健康人群全身多个部位的感染，其检出率和致死率均较高。本研究在631株KP中检出hvKP 56株，检出率为8.9%，与孙凯莉报道的[6]9.62%较一致，但明显低于其他地区[2,7]。有研究表明hvKP的检出率不同地区之间差异较大8.3%-73.9%[7]，hvKP的标本来源和临床分布在不同的地区不同的医院内有所不同，本研究结果表明hvKP主要来自于急诊病房和肝胆外科病房，穿刺液、血液和脓液为hvKP的主要标本来源，与其他地区[1,6]存在差异。因此，实验室应做好检测，总结本地区本单位的流行病学资料，给临床和感控部门提供依据。

KP菌体表面覆着大量的荚膜多糖，被认为是KP最重要的毒力因子，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57与hvKP相关性最高。本研究共检出5种血清型，以K1和K2型为主，主要携带aerobactin和rmpA基因，与文献[8]较一致，而与胡久丽[9]报道的来源于痰液标本所占比例略有差异，由此可见不同的标本来源所分离的hvKP其所携带的荚膜多糖类型也可不同。本研究的56株hvKP在MLST分型中，以ST23和ST86为主。研究表明，ST23是hvKP中最常见的序列型[9]，并且与K1血清型密切相关，本研究结果与之相符。

药敏结果显示，hvKP对临床常用的抗菌药物具有较高的敏感性，其耐药率明显低于cKP。尽管hvKP对临床常用的抗菌药物的敏感性较高，但是因其具有高毒力性和侵袭性，所导致的感染在临床上的治疗效果不佳，并且近年来，我国多个地区报道分离出耐碳青霉烯类高黏液性KP(CR-hvKP)，有学者[10]在56个多中心医院中的研究发现，在1052株CRKP中分离出CR-hvKP 55株，其分离率达到了5.2%，因CR-hvKP具有高侵袭性、高毒力性和高耐药性等特点，给临床抗感染治疗带来了极大困难。KP具有多种生物学表型[11]，不同地区、不同医院其分离率和临床分布均可不同，并且不同的生物学表型其临床治疗和预后也存在较大差异，因此，实验室应与临床通力协作，明确KP的流行病学特征，针对不同的生物学表型制定相应的治疗方案，提高抗感染的治疗效果。