高效液相色谱法测定茶枯粉中3种激素

2022-05-26刘纲勇黄锦波

化学分析计量 2022年5期

刘纲勇，黄锦波

(1.广东食品药品职业学院，广州 510000； 2.广州金评检测研究院有限公司，广州 510000)

茶枯粉是压榨野山茶油后留下的天然粉渣(茶粕)，含有丰富的粗蛋白及多种氨基酸、淀粉、糖类、纤维等营养物质，用其洗护头发可以去屑止痒、乌发防脱，使头发更加松软亮泽［1］，因此常常被用作洗发护发产品的原料。部分商家为使效果更明显，会添加生发类激素如米诺地尔或雄胺类激素，而《化妆品安全技术规范中》（2015年版）中明确禁止添加此类激素［2］。长期使用非法添加米诺地尔或雄胺激素类的化妆品，短期内的确可以大量长发，但是副作用非常明显，如头屑增多、皮肤瘙痒、甚至脱发加剧等，同时容易造成人体内分泌失调［3］，因此有必要对茶枯粉中米诺地尔与雄胺类激素进行准确分析。

目前，检测激素的主要方法为液相色谱法［4-5］、液相色谱-串联质谱法［6-7］。其中液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法能同时检测出几十种激素［8］，可以缩短分析时间，且有利于辨别假阳性，但是质谱法测定米诺地尔时，普通LC-MS仪的灵敏度相对较低，需要高分辨率的液相二级质谱仪（LC-MS／MS）才能准确有效的定量［9］，而一般实验室缺少如此昂贵的仪器。因此，在实际工作中，首选液相色谱法测定激素，其稳定性好，灵敏度高，如杨德辉等利用高效液相色谱法测定了化妆品中7种甾体激素［10］、李娟等利用高效液相法测定了化妆品中的6种糖皮质激素［11］，高卫东等利用高效液相法，测定了地塞米松等11种激素［12］。

目前采用液相色谱法测定米诺地尔与非那雄胺的检测方法相对较多［13］，但是度他雄胺的检测方法较少，主要集中在药物领域［14-16］。同时检测茶枯粉中的米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺三种激素的相关报道暂未发现。因此笔者通过优化前处理条件与色谱条件，建立了液相色谱仪测定茶枯粉中3种激素含量的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：1260型，配有自动进样器、二极管阵列检测器（DAD）、柱温箱、自动程序升温系统，美国安捷伦科技有限公司。

固相萃取小柱：Oasis HLB型、Aisimo WAX型，深圳逗点生物技术有限公司。

超声波清洗器：ZY-1001型，吉姆斯（广州）实验技术有限公司。

台式离心机：TDL-5A型，常州市金坛友联仪器研究所。

电子天平：BSA124S型，感量为0.000 1 g，德国赛多利斯集团。

米诺地尔标准品：质量分数为99.9%，批号为CDAA-740198，上海安谱实验科技股份有限公司。

非那雄胺标准品：质量分数为99.5%，批号为CDGO-100611，上海安谱实验科技股份有限公司。

度他雄胺标准品：质量分数为99.5%，批号为CDDM-D735002，上海安谱实验科技股份有限公司

甲醇、乙醇、乙腈：均为色谱纯。

三氯甲烷：分析纯。

茶枯粉样品：市售。

1.2 溶液配制

米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺混合标准储备液：分别称量米诺地尔0.010 2 g、非那雄胺0.010 4 g、度他雄胺0.010 6 g于同一只10 mL的棕色容量瓶中，甲醇稀释并定容，使得三种激素的质量浓度分别为1 018.98、1 034.80、1 054.70 μg/mL，冷冻避光保存。

米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺混合标准中间液：准确移取0.010 mL米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺混合标准溶液于100 mL容量瓶中，以甲醇定容，使得米诺地尔、非那雄胺与度他雄胺的质量浓度分别为101.91、103.48、105.47 μg/L。

质控样品：准确称量0.5 g空白质基样品于10 mL容量瓶中，并从米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺混合标准中间液中取0.02 mL溶液加入其中，使其质量浓度接近检出浓度，此时米诺地尔、非那雄胺与度他雄胺的质量浓度分别为2.04、2.07、2.10 μg/L。

1.3 色谱条件

检测器：二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：Extend-C18型柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；检测波长：250 nm；柱温箱温度：35 ℃；进样体积：10 μL；流动相：体积分数为90%的甲醇-水溶液，恒流模式，流量为1 mL/min。

1.4 实验方法

准确称取均匀的样品0.5 g（精确到0.001 g）于10 ml离心管中，加入3 mL乙腈进行提取，振荡1 min，超声15 min后，于离心机中以5 000 r／min进行离心，重复用3 mL乙腈提取三遍，合并有机相。合并后的有机相经过Oasis HLB固相萃取小柱（分别以5 mL甲醇、10 mL水预先活化）净化，待样品液流尽后，以甲醇自然流下洗脱，最终以甲醇定容于10 mL容量瓶中，样品溶液经过0.45 μm的微孔有机滤膜过滤后，上机待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件色选择

2.1.1 分析波长

对三种激素的混合标准溶液进行全波长（190～400 nm）扫描，发现有较高吸收的波长分别为200、232、280nm，三种激素对短波长的响应值均较高，但是在实验时采用，短波长对目标峰的干扰比较大，不利于分离成分复杂的样品。为减少干扰，又能保证目标物质有较高的响应值，试验选取检测波长为232 nm。

2.1.2 色谱柱的选择

对标准溶液分别进行测试，发现三种激素均能在C18色谱柱下分离，因此试验在没有进行样品净化的前提下考察了3种类型的C18色谱柱，分别为Extend-C18、Eclipse XDB-C18、SB-C18，其规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm。

试验结果发现，三种色谱柱均能有效的分离三种激素的标准品。但对于质控样品的分离，采用SB-C18作为分离柱时，米诺地尔的色谱峰与杂质色谱峰重叠在一起，完全不能分离，如图1所示；采用Extend-C18、Eclipse XDB-C18作为分离柱时，Extend-C18能有效地分离米诺地尔与杂质峰，其分离度为1.2，如图2所示；而Eclipse XDB-C18在分离米诺地尔与其它杂质峰时，其分离度仅为0.4，如图3所示。因此试验选择Extend-C18色谱柱作为分析柱。

图1 使用SB-C18柱的色谱图

图2 使用Extend-C18柱的色谱图

图3 使用Eclipse XDB-C18柱的色谱图

2.1.3 流动相

确定了检测波长与色谱柱后，以常见的甲醇-水溶液作为流动相进行试验，考察流动相配比。分别配制甲醇体积分数为10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-水溶液进行测试。试验结果发现，当有机相体积分数小于50%时，三个目标峰均检测不出，而流动相中的有机相体积分数为90%时，非那雄胺、度他雄胺的分离度与灵敏度明显大于有机相体积分数为70%时的流动相。因此试验采用甲醇体积分数为90%的甲醇-水溶液作为流动相。

2.2 样品处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

根据所测目标物的极性，试验考察了甲醇、乙醇、乙腈与三氯甲烷为提取剂时对3种激素回收率的影响（米诺地尔加标浓度为0.40 μg/L，非那雄胺与度他雄胺加标浓度均为4.00 μg/L），结果列于表1。由表1可知，甲醇与乙醇对米诺地尔的回收率较低，而三氯甲烷对非那雄胺与度他雄胺的回收率明显过高。而乙腈作为提取剂时，三个目标物的回收率均较理想，因此本试验选择乙腈作为样品提取剂。

表1 不同溶剂作为提取剂的回收率 %

2.2.2 净化条件的选择

HLB小柱采用的是苯乙烯二乙烯基苯共聚物作为填料，能有效除去油脂与蛋白质的干扰，有助于提高方法的灵敏度，降低基质的影响，而WAX小柱为混合型弱阴离子交换小柱，在pH 0～12的范围内稳定，对酸性的物质具有高选择性，耐受有机溶剂。考虑到这两个小柱的优点，试验在确定提取溶剂后，同时采用Oasis HLB固相萃取柱、Aisimo WAX固相萃取柱对含有同样浓度的质控样品进行净化试验，考察回收率。试验结果发现这两种固相萃取小柱均能有效地起到净化的作用，但是采用Aisimo WAX固相萃取小柱进行净化的色谱峰高度明显较低，这说明采用Aisimo WAX固相萃取小柱净化的目标物回收率不理想。因此试验选择Oasis HLB固相萃取柱作为净化柱。

2.3 色谱行为

在优化的色谱条件下，3种激素混合标准溶液的色谱图见图4。

图4 3种激素混合标准溶液色谱图

2.4 标准曲线与检出限

分别移取1.2项配制的混合标准中间液0.01、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于一组10 mL容量瓶中，得到米诺地尔的质量浓度为0.1～20 μg/L，非那雄胺与度他雄胺的质量浓度范围为2～50 μg/L。

取1.1中制备的系列混合标准工作溶液，按优化后的色谱条件对其进行测定，以各激素质量浓度为横坐标（x，μg/L），色谱峰面积为纵坐标（y），计算线性方程与相关系数。通过1.3项下的样品处理后，以目标物在仪器上的3倍信噪比（3S/N）计算检出限。线性方程，相关系数与检出限见表1。

表2 3种激素标准曲线考察结果

2.5 加标回收与精密度试验

以不含三种激素目标物的茶枯粉作为空白基质，分别移取1.1项下的混合标准中间液0.2、0.4、2 mL作为加标液，置于9只的10 mL离心管中，配制得到低、中、高三个水平的混合标准溶液，每个水平测试6次，并计算其加标回收率的平均值与测定结果的相对标准偏差，结果列于表3。由表3可知，加标回收率为88.3%～99.8%，测定结果的相对标准偏差为0.5%～4.1%，表明该方法精密度良好，满足分析要求。