陈华燕，徐苏华，黄敏菊

（广东省医疗器械质量监督检验所，国家药品监督管理局体外循环器械重点实验室，广州市生物医用血液净化材料研究与开发重点实验室，广州 510663）

双酚A作为一种工业原料被广泛应用于医疗器械的生产中［1］，如血液透析滤器、植入式心脏起搏器、牙科种植材料、呼吸麻醉设备等。医疗设备与人体接触时，其中残留的双酚A可通过皮肤、消化道、呼吸道、血液、体液等进入体内，影响生殖系统、神经系统、心血管系统，导致激素紊乱、代谢异常、神经发育迟缓、心脑血管疾病等危害［2-4］。血液透析器是血液与透析液进行交换的管路与容器，是血液净化治疗中的重要组成部分。血液透析器外壳多使用聚碳酸酯树脂，中空纤维膜则常用聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜等材料［5］。聚碳酸酯树脂常使用双酚A作为单体来进行合成［6-7］，双酚A的钾盐和钠盐则是生产聚砜膜的原料［8-11］，因此若是在合成过程中未完全聚合的双酚A残留在血液透析器的原料中，就有随着透析过程进入体的危险。许多临床数据表明［12-16］，血液透析治疗的患者体内双酚A水平远高于非透析的肾脏病患者，这说明在血液透析治疗过程中透析器材料中残留的双酚A的确会释放到人体体内，因此有必要对血液透析器中双酚A的溶出量进行检测，并设立相应法规标准限制其应用和残留量。

双酚A的检测主要集中于食品包装材料或日用生活品上，医疗器械如血液透析器中的双酚A的测定报道较少。彭文启［17］使用水、纯牛奶、10%乙醇与橄榄油作为迁移介质测定儿童产品中的双酚A迁移量；方晓明等［18］采用乙腈提取罐头食品中的双酚A；杨晓燕等［19］则选用3%的乙酸溶液作为浸泡液测定食品接触材料中双酚A的溶出量。现有方法用于测定医疗器械中的双酚A适应性较差，不能够针对器械的使用特点进行实验。透析器是血液净化的载体，若使用纯牛奶、食用油或者去离子水进行浸提，就会与实际使用中血液溶出双酚A的数值存在差异，不能很好地反应出透析器在血液净化使用中双酚A的真实溶出情况，因此选择合适的溶剂非常重要。郭利娟等［30］采用甲醇对血液透析器进行浸提，但甲醇的毒性和挥发性较大，不适合进行批量化检测。目前有研究表明乙醇-水混合溶液可以模拟血液，用于输液管路中增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的溶出的浸提实验［20-21］。采用乙醇-水的混合溶液模拟血液浸提透析器中的双酚A，既符合透析器的使用场景，溶剂又符合低毒要求。

在现有检测方法中，可以使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法［22-23］、液相色谱-质谱联用（LC-MS）法［24-27］、高效液相色谱（HPLC）法［28-30］、抗原抗体结合法［31］和酶联免疫法［32］等方法进行双酚A的测定，其中采用色谱法的占多数。因双酚A沸点高，需经过衍生化来增加其挥发性来提高气相色谱方法的检测能力［33］，但衍生化过程操作复杂且周期长，使其在实际的商业应用中发展受限；液相分离方法中双酚A则无需衍生化，大大简化流程，提高效率，便于操作方法的普及与商用。对比多项检测方法，色谱-质谱联用的检出限与定量限往往低于单独的液相色谱，但色谱-质谱串联的仪器价格普遍高于液相色谱难以普及。生物分析技术的抗原抗体结合法［31］和酶联免疫法［32］，具有高特异性，高敏感度和高通量的优势，检测速度快，但是该分析技术会出现假阳性，只能进行半定量分析，对于微量双酚A的测定有局限性。汪仕韬等［34］采用高效液相色谱法测定塑料包装材料中双酚A的含量，检出限可达0.05 mg/kg；郭利娟等［35］使用高效液相色谱荧光法测定血液透析器中双酚A含量时，最低检出限可以达到0.010 8 μg/mL，这些结果表明高效液相与荧光检测器的配合使用能够达到较低的检出限，有很高的灵敏度，适用于微量双酚A的测定。

在样品液制备方面，选择了密度为0.937 3～0.937 8 g/mL乙醇-水混合液作为血液模拟溶剂，模拟血液浸提透析器中的双酚A。所用溶剂低毒，且浸提液可以直接用于测定，无需进行浓缩纯化和衍生化。在仪器测试阶段，参考上述对比情况，选择了高效液相色谱联用荧光检测器的方法，可以简化操作过程和降低检出限。本方法针对透析器的特点，模拟临床使用条件，采用乙醇-水混合液进行浸提，结合高效液相色谱荧光法测定。该方法可用于血液透析器中双酚A含量的安全性风险评估，为有关监管部门提供技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：LC-20AT型，配荧光检测器，岛津企业管理（中国）有限公司。

滚压泵：JHBP-200B型，广州市暨华医疗器械有限公司。

数显电子恒温水浴锅：BL810C型，雅马拓科技贸易（上海）有限公司

分析天平：SECURA224-1CN型，感量为0.001 g，赛多利斯(上海)贸易有限公司。

液体密度计：测量范围为0.9～0.95 g/cm3，精度为0.000 5 g/cm3，衡水创纪仪器仪表有限公司。

双酚A（BPA）对照品：色谱纯，质量分数大于99.8%，批号为L1615026，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈：色谱纯，批号为197164，德国默克公司。

乙醇：分析纯，批号为20200623，广东光华科技有限公司。

实验室用水为二级水。

1.2 溶液制备

1.2.1 标准溶液的配制

分析天平精密称量0.100 g 双酚A，用密度为0.9375 g/mL的乙醇-水混合液溶解，用容量瓶定容至100 mL，摇匀。用乙醇-水混合溶液稀逐级释，分别配制成质量浓度为0.005、0.01、0.05、0.10、0.25、0.75 μg/mL的双酚A系列对照品工作溶液。

1.2.2 样品液的制备

参考临床中血液透析器的使用过程，取一套尽可能短的管路与透析器连接，取液体密度计测定密度ρ为0.937 3～0.937 8 g/mL的乙醇水混合液浸提溶剂500 mL，用恒流泵使溶剂以200 mL/min的流量循环冲洗血室6 h，同时用乙醇-水溶液充满透析液室，循环结束后，把血室和透析液室内的溶液全部吹出，收集全部液体冷至室温作为检验液。取同体积乙醇-水混合液，不装血液透析器同法制备空白对照液。

图1 血液透析器双酚A浸提示意图

1.3 实验步骤

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil®ODS-SP型，250 mm×4.6 mm，5 μm，岛津企业管理（中国）有限公司；激发波长：227 nm；发射波长：313 nm；柱温：35 ℃；进样体积：20 μL；流动相：A相为乙腈， B相为水，梯度洗脱条件列于表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2 测定方法

以0.45 μm膜过滤检验液和对照品溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪测定，利用色谱峰面积计算检验液中双酚A含量。

2 结果与讨论

2.1 浸提溶剂的选择

双酚A易溶于甲醇、乙醇、醋酸、丙酮、苯等有机溶剂，难溶于水。甲醇、苯毒性较大，容易挥发，而丙酮属于管制药品，较难获得。目前有研究表明乙醇-水混合溶液可以替代血液模拟溶剂来浸提与血液接触的医疗器械中的双酚A［20］，《YYT 0927-2014 聚氯乙烯医疗器械中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)溶出量测定指南》［21］中对于接触血液或者血液成分的医疗器械如输血器、透析器、氧合器和血液循环装置等，一般可考虑采用密度为0.937 3～0.937 8 g/mL的乙醇-水混合液的替代血液作为浸提溶剂。

因此试验使用乙醇-水混合液作为血液透析器的模拟浸提试剂，使其以临床使用相同的方式和条件进行浸提，然后取部分浸提液作为试验液。

2.2 激发波长与发射波长的确定

目前研究显示［18，36-37］，双酚A的激发波长在227 nm左右，发射波长在313 nm左右有较强的吸收峰，为了与标准方法一致，并增加可操作性，试验参考《GBT 23296.16-2009 食品接触材料高分子材料 食品模拟物中2，2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚A）的测定 高效液相色谱法》［28］中双酚A的发射波长和激发波长，选定激发波长为227 nm，发射波长为313 nm。

2.3 专属性试验结果

分别取空白供试液、质量浓度为0.1 μg/mL的双酚A标准品溶液、供试品溶液，在1.2色谱条件下进行测定，空白溶液、标准品溶液、供试品溶液色谱图见图2、图3、图4。由图3结果显示，双酚A的保留时间约为5.647 min，理论塔板数为8 750，分离度为5.452。待测物质与其它峰无干扰，样品供试液的出峰位置表明该色谱条件可以用来测定双酚A的含量，方法专属性良好。

图3 0.1 μg/mL双酚A标准品色谱图

图4 双酚A供试品色谱图

2.4 线性方程、定量限与检出限

取1.2.1中制备的双酚A系列对照品工作溶液，按照1.2的色谱条件进行分析，以各组分色谱峰面积为纵坐标（Y）、对照品质量浓度为横坐标（X，μg/mL）作图。计算得到双酚A的线性回归方程为Y=1.498 0×107X+62 886.4，相关系数为0.999 9。说明本方法测定双酚A的质量浓度在0.005～0.75 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好。

取双酚A对照品溶液，用乙醇水混合液按需求等比稀释，对得到的低浓度对照品溶液进行测定。检测质量浓度为0.005 μg/mL，试验得到（S/N）为11.42倍的信噪比，符合大于10倍信噪比的定量要求。以3倍的信噪比（S/N）作为检出限，检出限为0.001 3 μg/mL。

2.5 重复性与重现性试验

根据中国药典（2020年版），取质量浓度为0.005、0.05、0.25 μg/mL的双酚A标准品，各连续测定3次，计算色谱峰面积的相对标准偏差（RSD），结果列于表2。由表2可知，方法重复性RSD为1.10%～2.66%。

表2 重复性试验结果

在不同日期由不同分析人员平行制备同重复性浓度相同的各3份标准品连续测定计算峰面积的相对标准偏差（RSD），结果列于表3。由表3中可以看出，重现性RSD为2.98%～3.31%。

表3 重现性试验结果

根据中国药典（2020年版）9101药品分析方法验证指导原则，当样品质量浓度在1 μg/mL级别时，重复性应不大于8%，重现性RSD应不大于16%。根据表2、表3可知，该方法符合中国药典的相关规定。

2.6 加标回收试验

取样品浸提液各9份，以样品浸提液作为基底，分别加入适量的双酚A对照品溶液，制备成低、中、高三个理论浓度分别为0.05、0.1、0.25 μg/mL的样品各三份，用0.45 μm膜过滤检验液，分别测定3次，计算平均回收率，结果列于表4。

表4 加标回收率试验结果

根据中国药典（2020年版）9101药品分析方法验证指导原则，当样品浓度为1 μg/mL级别时，回收率应符合75%～120%，RSD值不大于5%。从表4可以看出，平均回收率为92.67%～97.33%，RSD为1.04%～2.37%，结果符合中国药典的相关要求。

2.7 样品双酚A的溶出量测定

分别取4种样品的浸提液，每组样品浸提液平行测定3次，将得到的质量浓度结果带入下式（1），结果列于表5。

表5 血液透析器中双酚A溶出量结果

式中：m——每套样品溶液双酚A溶出量，μg/套；

c——样品供试液中双酚A实测值，μg/mL 。

EFSA（欧洲食品安全局）设定双酚A的每日耐受摄入量为50 μg/(体重·天)，即0.05 mg/(kg·d)，并在2015年将其临时调整到4 μg/(kg·d)，即0.004 mg/(kg·d)［38-39］。

采用《GB/T 16886.17—2005 可沥滤物允许限量的建立》中［40］的公式推导，得到人体可耐受量为0.056 mg。根据表5可知，4种样品的每套双 酚A含 量 分 别 为33.5、45.5、21.5、43.5 μg/套，均低于人体可耐受量0.056 mg。

3 结语

建立了一种高效液相色谱荧光法，测定血液透析器双酚A的溶出量，乙醇-水混合液作为血液模拟溶剂浸提血液透析器，样品液可以直接用于色谱测定，不需要进行活化淋洗富集衍生化等过程，大大简化了操作流程。双酚A的保留时间约为5.647 min，出峰快，检测效率高。此方法有较低的检出限0.001 3 μg/mL，证明此方法有较高灵敏度，适用于医疗器械中微量双酚A的测定。