林禹澎 姜英子* 解生旭 徐雅娟

1.延边大学药学院，吉林 延吉 133002；2.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012

怀古颗粒由骨碎补6 g、山茱萸2.2 g、怀牛膝2.2 g、川芎1.2 g、鹿茸0.16 g五味药材组成，具有增强骨密度，预防骨质疏松保健功能。五味药材作为骨伤科常用中药，其在治疗骨质疏松症方面的运用已经得到广泛认可，为临床治疗骨质疏松方剂中的常用药物[1～6]。骨碎补为方中君药，具有补肾强骨，治筋骨瘘软之功效[7]，柚皮苷为其主要成分。研究采用HPLC高效液相色谱法测定怀古颗粒中柚皮苷的含量，为怀古颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-2010C高效液相色谱仪；FA2004B万分之一天平；GA-425十万分之一天平；KQ-300DE型数控超声波清洗器。

1.2 材料 怀古颗粒(厂家：北京海润德医药集团有限公司；批号：20181201，20181202；20181203)对照品柚皮苷购自中国食品药品检定研究院；甲醇购自Fisher，为色谱纯；水为双蒸水自制；冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司，为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性 采用安捷伦Eclipe XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相：甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长为283 nm；进样量：10 μL；上述色谱条件下，柚皮苷对照品与其他组分峰分离度良好。色谱图如图1所示。因该颗粒所含成分较多，此条件下其他成分无法得到有效的分离，故在2～4 min有些许杂峰，其不影响本实验结果。

2.2 对照品溶液制备 取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷0.305 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取本品0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率40 KHZ)30 min，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性及范围 精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，以柚皮苷进样量(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，结果显示，柚皮苷含量在0.061～0.427 μg范围内线性良好。

2.5 精密度考察 取2.2项下对照品溶液，精密吸取10 μL，连续进样6次，记录柚皮苷峰面积。以积分峰面积测定结果的相对偏差，反映仪器的精密度，计算其RSD值为0.85%，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察 根据2.3项下方法制得供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、24 h后，精密吸取10 μL，进样，测定供试品中柚皮苷的峰面积值，计算RSD值为1.16%，表面柚皮苷在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性考察 称取同一批供试品6份，每份精密称定0.25 g，按2.3项下方法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积，计算柚皮苷的含量，得RSD值为2.13%。表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

2.8.1 对照品溶液的制备 同2.2项下对照品溶液的制备。

2.8.2 加样对照品溶液制备 取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.32 mg的溶液，即得。

2.8.3 回收率供试品溶液制备 精密量取已知含量的供试品溶液0.125 g，共6份，分别精密加入加样对照品溶液1 mL后，按2.1项下色谱条件进行测定，结果见表1。计算加样回收率，结果为：柚皮苷的平均回收率为99.01%，RSD为4.41%。

表1 加样回收率测定结果

3 讨论

3.1 色谱柱考察 对不同型号的色谱柱进行了考察，在SHIMADZU VP-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三根色谱柱中，XDB-C18的保留时间最短为10.2 min，理论塔板数最大，为2888，故选用此柱。

3.2 流动相考察 在甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)的基础上对流动相进行了考察，结果显示以甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)为流动相时所得的供试品色谱图峰型较好，且保留时间更短，理论塔板数最大，故选流动相比例为甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)。

3.3 提取方法考察 在怀古颗粒供试品溶液的制备中，考察了不同的提取方法，分别为甲醇超声提取方法、乙醇超声提取方法和甲醇加热回流提取方法。三种提取方法测定的含量分别为2.584、2.425、2.537 mg/g，发现甲醇超声提取方法柚皮苷损失较少，方法操作简便，故选用次提取方式。

3.4 方法学考察 由线性考察结果可知柚皮苷在含量为0.061～0.427 μg范围内线性良好，可作为怀古颗粒质量控制的指标；精密度考察的RSD为0.85%，说明仪器精密度良好；重复性考察的RSD为2.13%，表面该含量测定方法重复性良好；稳定性考察的RSD为1.16%，表面柚皮苷在24 h内稳定性良好；回收率实验的平均回收率为99.01%，RSD为4.41%，符合中华人民共和国药典的要求。

4 结论

怀古颗粒中骨碎补主要含黄酮类、三萜类等成分[8]；山茱萸主要含有环烯醚萜类、鞣质等成分[9]；怀牛膝主要含有甾酮类、生物碱等成分[10]；川芎主要含有酚类、有机酸类等成分[11]。综上所述，本实验结果显示所建立的含量测定方法能有效地分离出柚皮苷成分，且所建立含量测定方法重现性、加样回收率、精密度等均符合药典规定，故将此方法用于怀古颗粒中柚皮苷的含量测定。