张莉娟，谷新晰，孙记录，田洪涛，卢海强

（河北农业大学食品科技学院 河北 保定 071001）

雷山鱼酱酸是贵州黔东南苗族自治州雷山县的传统调味品，是以鲜红椒与当地野生河鱼为主要原料，配以食盐、生姜、白酒、醪糟、香辛料等辅料，采用传统的密闭发酵制成。鱼酱酸虽有悠久的加工及食用历史，但是其研究大多停留在生产技术规范[1]、加工工艺[2]、营养成分、矿物质、有机酸和辣椒碱等方面[3]。目前影响鱼酱酸发酵的微生物区系及挥发性风味物质等还不清楚，尚缺乏全面、系统的研究，因而限制了雷山鱼酱酸的标准化生产。

我国是农业大国，以农产品作为食物的重要来源，农产品发酵是我国食品加工的重要技术来源之一。因发酵过程中多种微生物的存在，导致一系列复杂的生化反应，使产品特性品质不一[4]。目前，高通量测序技术已广泛应用于多种发酵食品中的微生物种类多样性的研究，如马冰涛等[5]采用高通量测序技术对老白干香型大曲中的微生物进行测序，通过调控对风味成分贡献较大菌属来提高白酒品质；Liu 等[6]研究了锦州虾酱发酵过程中，细菌群落动态变化与挥发性物质动态变化的相互关系，探索微生物菌群与挥发性物质之间的影响；于美娟等[7]探讨固态发酵鱼中细菌群落多样性与品质的关系，揭示样品中细菌数量和结构组成与品质的相关性，以控制加工条件。

固相微萃取（SPME）能够减少风味物质的散失[8]，集采样、萃取、浓缩、进样为一体，保证了食品风味的完整性，现广泛应用于食品风味物质的定性、定量分析中。气相色谱-质谱联用技术（GCMS）可对复杂有机化合物进行有效分离和定性[9-11]，作为分析挥发性物质的有效工具，具有操作简便、高效、灵敏度高等特点。采用SPME-GC-MS 方法分析鱼酱酸中挥发性物质对样品进行全面观察，以达到微观分析与宏观处理相结合的风味物质综合分析。

本研究采用高通量测序技术分析雷山鱼酱酸细菌群落组成和结构，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术解析鱼酱酸中的风味成分，探究其主要微生物、关键挥发性成分及品质特性，为雷山鱼酱酸的标准化生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雷山鱼酱酸，贵州省雷山县永乐冷府鱼酱酸食品有限责任公司。

有机酸标准品：酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸，成都市科龙化工试剂厂；17种氨基酸标准品：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸，Agilent 公司；内标正亮氨酸和异硫氰酸苯酯 （PITC），美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取装置，上海安谱科学仪器有限公司；QP2010Plus 气相色谱质谱仪，日本岛津公司；JW-3021H 台式高速离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；高效液相色谱仪，惠州市华高仪器设备有限公司；高速均质器，上海力辰科技公司；高速粉碎机，上海力辰科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 微生物群落的高通量测序分析

1.3.1.1 基因组DNA 提取和PCR 扩增 采取雷山鱼酱酸样品10 g 于5 000×g 离心10 min，根据参考文献[12]中的CTAB 法并作修改，提取鱼酱酸中的DNA。采用NEB 公司的Q5 高保真DNA 聚合酶，对细菌16S rDNA V3-V4 区域进行扩增[13]，细菌V3-V4F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，细菌V3-V4R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。扩增体系（50 μL）：5×reaction buffer 10 μL，5×GC buffer 10 μL，d NTP （2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物 （10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 23 μL，Q5 DNA 聚合酶1 μL。扩增参数：预变性94 ℃5 min；变性94 ℃30 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃1 min，30 个循环；终延伸72 ℃10 min。

1.3.1.2 Illumina Miseq 测序 使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（Biomed）对扩增产物进行胶回收纯化。利用荧光试剂Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，在酶标仪（BioTek，FLx800）定量仪器上对PCR 扩增回收产物进行荧光定量。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库，并采用Agilent High Sensitivity DNA Kit 进行质检，确保制备的文库有且只有单一的峰，且无接头。使用MiSeq Reagent Kit V3（600 个循环）试剂在MiSeq 测序仪上对目的片段进行双端测序，为保证测序质量，建议目标片段的最佳测序长度为200～450 bp[14-15]。

1.3.1.3 数据处理 测序得到的原始双端测序数据，以FASTQ 格式保存。在原始数据中存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，采用DADA2 方法得到有效数据[16]。即运用QIIME 2 软件对原始数据进行去引物、质量过滤、去噪、拼接、去嵌合体，以100%相似度聚类（或称去重）。经过DADA2 质控后产生的去重的序列称为ASVs（Amplicon sequence variants），或称为特征序列，而这些序列在样本中的丰度表称为特征表。最后基于上述分析结果，运用QIIME 2 软件和R 语言ggplot2 包进行物种水平上组成成分分析和可视化，进行Alpha 多样性分析[17]。

1.3.2 鱼酱酸中挥发性物质的测定

1.3.2.1 顶空固相微萃取进样 参照卢靖等[18]的方法，取2 g 样品加入到20 mL 顶空进样瓶中，密封。60 ℃水浴加热，平衡10 min，将75 μmol/L PDMS/CAR 萃取头插入进样瓶顶空萃取。顶空吸附30 min 后，插入GC 进样口解吸5 min。

1.3.2.2 GC-MS 分析 色谱条件：色谱柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为氦气，流速为1.0 mL/min。升温程序：起始温度32 ℃，保持5 min；然后以4 ℃/min 的速率升温到130 ℃；最后以10 ℃/min 的速率升温到200 ℃。进样口温度250 ℃。

质谱条件：电子电离（Electron ionization，EI），电子轰击能量为70 eV，扫描范围40～350 m/z[18]。离子源温度230 ℃。

利用计算机NIST 谱库进行数据检索，各组分相对含量按峰面积归一化法计算[19]。

1.3.3 鱼酱酸中有机酸的测定 根据《食品安全国家标准 食品有机酸的测定》（GB 5009.157-2016）[20]中的方法，进行雷山鱼酱酸中有机酸的测定。

1.3.4 雷山鱼酱酸中脂肪酸的测定 根据《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》（GB 5009.168-2016）[21]中内标法的方法，对雷山鱼酱酸中的脂肪酸进行测定。

1.3.5 雷山鱼酱酸中氨基酸的测定 用氨基酸液相自动分析仪对雷山鱼酱酸中的氨基酸酸进行测定。参照Zeng 等[22]的方法并稍做改动，对雷山鱼酱酸的样品进行处理。流动相的配比和游离氨基酸的标准品可参照华倩[23]的方法并稍做修改，通过与游离氨基酸标准品相比，根据保留时间和峰面积来计算含量。

2 结果与分析

2.1 微生物多样性分析

2.1.1 微生物的Alpha 多样性分析 通过细菌V3-V4 测序，获得115 616 个序列。运用QIIME2软件进行DADA2 去噪后，获得102 586 个序列。所得序列在100%的相似水平下进行统计分析，获得1 515 个ASVs。

Coverage 指数、Chao1 指数和Shannon 指数分别用于评估鱼酱酸样品中物种的测序深度、丰度和分布多样性[24]。Coverage 指数越高，表明样本中序列数据测出越全面；Chao1 指数与样品中微生物群落丰度成正相关；Shannon 指数则与样品微生物多样性有关，数值越大，微生物种类越丰富。由表1可知，雷山鱼酱酸样本中微生物Coverage 指数大于0.99，说明样品文库中序列基本上都被测出，可进行鱼酱酸样品中大部分微生物多样性的分析，也为后期研究雷山鱼酱酸深层次的生物信息学提供了可信度。

表1 雷山鱼酱酸菌群微生物多样性指数Table 1 Microbial diversity index of Thunder mountain fish sauce acid

2.1.2 雷山鱼酱酸中不同水平细菌群落组成分析 根据对雷山鱼酱酸样品的测序结果分析可知，样品中共有22 个细菌门被检出，其种类丰富度较高，所占总序列数差异大。由图1a（仅展示了前20个优势菌门的含量）可知，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）是鱼酱酸中的优势菌门，相对丰度分别为39.13%和30.68%，占据菌群总量69.81%。其余为放线菌门（Actinobacteria，17.47%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，8.09%）、蓝藻门（Cyanobacteria，1.464%）、软壁菌门（Tenericutes，1.226%）、栖热菌门（Deinococcus-Thermus，0.465%）等。近年来，许多研究表明厚壁菌门和变形菌门微生物是高蛋白食品中的优势细菌门，在乳制品[25]、肉制品[26]及水产品中都十分常见[27-28]，与本研究结果一致。刘洋等[29]对四川辣椒酱的研究中，探寻出变形菌门是发酵前期的优势菌门，厚壁菌门是辣椒酱发酵中、后期的优势菌门。在Zang等[30]对中国传统发酵鱼酸鱼发酵过程中微生物群落演替的动态和多样性的研究中，也发现了变形菌门、厚壁菌门是酸鱼发酵过程中的主要优势细菌。在属的水平上，样品共检出249 个细菌属。如图1b 所示（只展示了前20 个优势菌属的含量），节杆菌属 （Arthrobacter，11.246%）、雷尔氏菌属（Ralstonia，10.929%）为样品的优势菌群，另外瘤胃菌属（Ruminococcaceae UCG-014，7.343%）、苍白杆菌属（Ochrobactrum，6.639%）、乳杆菌属（Lactobacillus，5.443%）、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas，4.945%）、不动杆菌属（Acinetobacter，4.402%）、假单胞菌属（Pseudomonas，4.214%）、弧菌属（Vibrionimonas，3.635%）、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae，1.939%）等也具有一定的丰富度。节杆菌属可从葡萄糖或其它糖中产生少量酸或不产酸，有的不抗酸。雷尔氏菌对含钾酸盐矿物也有较强的分解能力[31]。假单胞菌属的细菌多具有分解蛋白质和脂肪的能力，耐盐性的特性让其具有生存优势。然而也有报道证明假单胞菌属会导致腹泻[32]。乳杆菌属为兼性厌氧菌，广泛分布于自然界中，污染乳制品、肉制品、水产品等高蛋白食品后可引起腐败变质。雷山鱼酱酸样品中的优势菌属与之前报道过的中国传统发酵鱼酸鱼发酵过程中微生物的优势菌属不同，酸鱼主要优势菌属以乳酸菌（Lactococcus）、大球菌（Macrococcus）和葡萄球菌（Staphylococcus）为主，可能是因为酸鱼在发酵过程中以自发酵为主[33]。传统韩国发酵鱼露（Myeolchi-aekjeot，MA）的细菌群落结构与本研究中观察到的也不同，在发酵过程中，以四联球菌属（Tetragenococcus）和盐厌氧菌属（Halanaerobium）为主，这种变化主要是由于盐度条件，因为在高盐度下的鱼酱发酵导致各种嗜盐或耐盐微生物的发展[34]。

图1 雷山鱼酱酸中的微生物在门和属水平的分布情况Fig.1 Distribution of microorganisms in Lei Shan fish sauce acid at phylum level and genus level

2.2 GC-MS 鉴定雷山鱼酱酸挥发性成分

由表2可知，雷山鱼酱酸样品中检出挥发性成分60 余种。主要挥发性成分包括萜烯类、醚类、醇类、酸类、酯类，各占挥发性成分总量的33.65%，33.53%，16.45%，7.82%，6.47%。还有微量挥发性成分，包括芳香族类（0.6%）、酮醛类（0.65%）、烷烃类（0.22%）等物质。萜烯类、醚类是鱼酱酸中主要的挥发性物质，对鱼酱酸风味物质有巨大贡献。本研究检出的多种萜烯类化合物，大多数来自于香辛料[35]和辣椒[36]。这类烯烃气味强烈，阈值较低，在鱼酱酸风味的形成过程中提供巨大贡献。且右旋萜二烯（13.12%）、α-姜黄烯（2.71%）、姜烯（2.41%）等的相对含量较高。右旋萜二烯香气检出阈值4～229 μg/kg，呈甜的甜橙和柑橘类风味。蒎烯、香橙烯这些烯烃类物质不仅可以赋予鱼酱酸柑橘香味，在品质提升方面也有很大帮助。含量较高的姜烯、α-姜黄烯可能与鱼酱酸制作过程中添加的生姜有密切关系，其它萜烯类成分的来源可能是加工过程中添加的辅料，如大料、肉桂、花椒、丁香和砂仁等[37]，是促进鱼酱酸风味形成的主要物质。罗勒烯具有青香、热带果香、菇香、辛香香味、草药味[38]。

表2 雷山鱼酱酸中挥发性成分及相对含量测定结果Table 2 Volatile components and their relative contents in Lei Shan fish sauce sour

（续表2）

本研究中检出的4 种醚类，其中相对含量最高的是茴香脑（23.25%），是产生酱香的重要物质[37]，具有浓郁的茴香气，略微甜味。

在此鱼酱样品中醇类的种类相对较为丰富，醇类通常具有芳香、蘑菇香、酸败和土气味，对鱼酱的发酵有着重要作用。芳樟醇贡献百合花香气，且沸点低，属于上等的天然香料；松油醇，具有紫丁香的香气，这些醇类物质赋予了鱼酱酸温和、纯正的香气。芳樟醇、4-萜烯醇等阈值较低，对风味的形成贡献较大[39]。酸类具有醋味和酸味，是微生物发酵的主要产物，来源于糖类的分解或者氨基酸代谢。鱼酱酸中的山梨酸具有防腐保鲜作用，可以维持鱼酱酸的品质，在食品、化妆品、农药、烟草等行业中都被广泛应用[38]。酸类物质大部分来自于碳水化合物的分解产物，还有一部分来自于氨基酸的代谢产物。鱼酱酸中酯类化合物可能是来源于原料中的小河鱼被多种微生物发酵代谢，或者是在发酵过程中的产物酸与醇发生酯化反应，贡献食品特殊的水果香味[40]，如苯甲酸乙酯稍带有水果气味，也是促进鱼酱酸风味形成的重要物质。酮类一般是在美拉德反应、氨基酸降解或其更深层次反应生成，且适量的酮类会贡献甜的花香和果香风味。苯甲醛在鱼类产品中普遍存在，表现为令人愉快的杏仁味，并通过Strecker 降解途径从苯丙氨酸产生，或通过氧化降解途径产生亚麻酸。

2.3 雷山鱼酱酸产品品质分析

2.3.1 雷山鱼酱酸中有机酸的分析 有机酸可以在大分子物质水解以及微生物发酵下产生，可以为发酵食品提供独特的风味[41]，改变其它风味物质的味感。雷山鱼酱酸中的酸类物质来源于鱼酱酸发酵过程中饱和脂肪酸的氧化降解。酸类物质既是香味物质又是呈味物质，能够影响鱼酱酸的酸味和甜味，从而对鱼酱酸的品质产生影响。经检测，雷山鱼酱酸样品中主要有机酸为柠檬酸，含量为269.6 mg/kg。在叶陵等[42]测定自然发酵辣椒有机酸的结果中，柠檬酸含量最高，且此研究表明辣椒中原有的柠檬酸、苹果酸等共同赋予了传统腌辣椒丰富、爽口、滋润的酸味，表明雷山鱼酱酸中产生的柠檬酸也可能来自原料中的辣椒。周晓琴等[3]在以4 种代表性的鱼酱酸为研究对象测其有机酸时，主要有机酸为乳酸，而且4 种不同来源的鱼酱酸中乳酸含量差异显著，导致这种现象可能是由于原料来源、环境微生物和发酵时间的不同。华倩[23]在研究中也表明鱼酱酸中含有少量柠檬酸，而且适当浓度的柠檬酸不仅可以提高产品的风味品质，还能赋予鱼酱酸产品丰富的滋味特征。

2.3.2 雷山鱼酱酸中脂肪酸的分析 脂肪酸是脂肪酸氧化的底物，可以在氧气含量充足的情况下氧化分解生成大量能量，对产品呈香和人体供能至关重要。另外，脂肪酸还是食品的重要组成成分，有降血压、降血脂、抗血栓等作用，其中不饱和脂肪酸具有预防动脉粥样硬化的作用[43]。经过分析，检测出雷山鱼酱酸样品中的脂肪酸为亚油酸（0.047 g/100 g）、油酸（0.0424 g/100 g）、棕榈酸（0.035 g/100 g）、α-亚麻酸（0.0131 g/100 g）、硬脂酸（0.00946 g/100 g）、棕榈油酸（0.00692 g/100 g）、肉豆蔻酸（0.00484 g/100 g）。这与华倩[23]在接种微生物发酵剂对鱼酱酸品质提升的研究中测定的脂肪酸成分相似。亚油酸作为人体的2 种必需脂肪酸之一，参与生物合成类二十烷酸物质作为前体可以合成花生四烯酸。曾有研究表明，亚油酸能参与胆固醇代谢形成亚油酸胆固醇酯，在保护心血管健康，预防动脉粥样硬化方面，具有很好的作用[44]。油酸、棕榈酸是单不饱和脂肪酸，油酸在延缓动脉硬化上也有一定作用，对高糖和高血脂病人具有很好的保健作用[45]。棕榈酸可以降血脂、降血压、促进血液微循环，从而预防和减少心血管疾病的发生[46]。肉豆蔻酸会提高血胆固醇含量，若超过一定的量则不利于人体健康。

2.3.3 雷山鱼酱酸中氨基酸的分析 游离氨基酸是鱼酱酸滋味的重要来源，也是挥发性风味的重要前体物质。由表3可知，雷山鱼酱酸中游离氨基酸总量占3.91%。呈味氨基酸在口感方面起至关重要的作用，依照氨基酸呈味特征分析，雷山鱼酱酸样品中的氨基酸可分成鲜、甜和苦3 类。从表3中得出，谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸为雷山鱼酱酸中的主要游离氨基酸。谷氨酸、天门冬氨酸对鲜味特征有直接贡献作用，二者含量占总游离氨基酸的26.09%，决定了鲜味在鱼酱酸呈味过程中起主导作用。在张文华等[47]对银鱼鱼酱酸的研究中，谷氨酸和天冬氨酸含量最高，分别为0.42%和0.32%，这与本研究的检测结果相似。对雷山鱼酱酸甜味有直接贡献的为丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸等。亮氨酸、精氨酸、缬氨酸等在苦味方面有直接影响。在鱼酱酸样品中共检测出人体必需氨基酸6 种，其中亮氨酸含量为0.3%，是必需氨基酸含量中最高的，它可以与异亮氨酸和缬氨酸一起调节血糖，为身体组织提供能量。

表3 雷山鱼酱酸中游离氨基酸的组成及质量分数Table 3 The composition and percentage content of free amino acid in Lei Shan fish sauce sour

3 结论

本研究通过高通量基因测序技术，对雷山鱼酱酸中微生物的多样性和丰度进行鉴定，研究发现雷山鱼酱酸含有22 个细菌门，249 个细菌属。变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）是主要的细菌门，占了鱼酱酸中细菌门总数的69.81%。节杆菌属（Arthrobacter） 和雷尔氏菌属（Ralstonia）为鱼酱酸的优势菌属，占鱼酱酸细菌属中的22.18%，充分说明雷山鱼酱酸中细菌属的多样性和丰富度较高。同时利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术，共检测出鱼酱酸中的挥发性成分70 种，萜烯类、醚类、醇类、酸类、酯类这5 类主要挥发性成分的含量占挥发性成分的97.92%。并检测出雷山鱼酱酸中的主要有机酸柠檬酸为269.6 mg/kg，含量最高的脂肪酸为亚油酸（0.047 g/100 g），主要呈味氨基酸为鲜味氨基酸。本研究为雷山鱼酱酸的微生物多样性研究和风味探究，以及品质改良提供了科学依据，能够丰富人们对雷山鱼酱酸的现有认识，同时也为鱼酱酸的安全生产和工业化生产提供理论指导。