李 勇，孔阳阳，郭亚男

（1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏农林科学院，宁夏 银川 750002）

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）能引起牛的肺炎、乳房炎、关节炎、中耳炎和生殖系统障碍， 也是牛呼吸系统疾病（bovine respiratory disease，BRD）的主要病原之一［1］。 该病在世界范围内流行，我国于2008 年首次报道了肉牛的支原体肺炎，发病率50%～100%，病死率高达10%～50%，给养牛业造成了巨大的经济损失［2］。 M.bovis 通常与其他病毒或细菌发生混合型感染， 能在被感染组织的黏膜表面定殖， 并有效抑制机体免疫系统对其产生作用［3］。 当前对于M.bovis 尚无有效疫苗，主要控制措施是抗生素治疗［4］。 M.bovis 无细胞壁结构，不能合成叶酸，对内酰胺酶类和磺胺类药物不敏感［5］。 研究显示，M.bovis 易受到干扰自身蛋白质或DNA 合成的药物影响，临床上常用如喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类抗生素进行治疗，但是这些药物普遍存在治疗周期长、疗效差、耐药性产生快等缺点［6］。

体外药物敏感性分析不但能为临床治疗筛选敏感药物，提高治疗效果，还可用于监测M.bovis耐药性产生的趋势。因此，该研究收集了宁夏地区规模化牛场发生的肺炎、关节炎、临床型乳房炎病例中分离鉴定的74 株M.bovis，采用微量肉汤稀释法对庆大霉素、大观霉素、卡那霉素、恩诺沙星进行体外药物敏感性分析，以期为临床治疗M.bovis提供科学合理的用药参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

74 株M.bovis 分离自宁夏银川、石嘴山、吴忠和固原地区规模化牛场患有肺炎（n=35）、临床型乳腺炎（n=18）、关节炎（n=21）病牛的肺组织、乳汁、关节液。所有菌株由宁夏农林科学院动物科学研究所提供。

1.1.2 培养基与药品

PPLO 培养基，北京索莱宝公司产品；恩诺沙星、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素可溶性粉针剂，金克隆（北京）生物技术有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 M.bovis 的复苏与鉴定

将存于-20 ℃含20%甘油的M.bovis 菌液，吸取100 μL 接种于PPLO 液体培养基，置于培养箱中37 ℃培养48～72 h。 再取出20 μL 复苏菌液接种至60 mm PPLO 琼脂平板上。 随后置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养48～72 h， 显微镜下标记出典型的M.bovis 单菌落（荷包蛋样菌落），将其再接种于PPLO 液体培养基培养。 取培养物进行16S rDNA 通用PCR 和uvrC 特异性PCR 检测［7］。

1.2.2 M.bovis 颜色变化单位的测定

将复苏鉴定后的M.bovis 用PPLO 液体培养基作10 倍递增稀释， 置于37 ℃CO2培养箱中培养48～72 h，观察培养液颜色，当颜色由红色变为黄色表示有M.bovis 生长。 以出现颜色变化的最后1 管对应的M.bovis 稀释倍数作为颜色变化单位，表示为CCU/mL。

1.2.3 抗菌药液的配制

根据庆大霉素、大观霉素、卡那霉素、恩诺沙星的药物特性，用相应溶剂将其溶解（恩诺沙星先用0.1 mol/L 氢氧化钠溶解）， 然后用去离子水将药液稀释为1 mg/mL 储存液。 抗菌药液定容前，将pH 值调至7.0， 以避免导致M.bovis 培养物出现非特异性颜色变化。 所有抗菌药液配成贮存浓度后，再经0.2 μm 的微孔滤器过滤除菌，避免光照，将贮存液保存于-80 ℃备用，使用前将储存液用去离子水稀释至所需工作液浓度，工作液保存于4 ℃备用。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量肉汤稀释法测定M. bovis 的MIC值。取96 孔板，在1～9 列各孔中加入pH 值7.6 的100 CCU PPLO 液体培养基，然后在第1 列中加入工作浓度的抗菌药液， 充分混匀后从各孔中取100 μL 加至第2 列各孔， 照此倍比稀释至第9 列后，弃去100 μL，使各孔体积相同。在第10 列各孔中加100 μL PPLO 培养基作为M.bovis 生长的阳性对照； 第11 列各孔中加入200 μL pH 值6.8 的呈黄色PPLO 培养基作对照；第12 列各孔中加入200 μL 培养基作为无菌阴性对照呈红色。

将复苏鉴定后的M. bovis 菌液按1∶10 的比例接种至PPLO 液体培养基，置37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h， 菌量达到108～109CCU/mL 后，再将菌液稀释至104CCU/mL 后备用。 在1～9 列各孔中加100 μL 预先稀释好的菌液；第10 列各孔中加100 μL 菌液；第11、12 列不加菌液。 为确保结果的准确性，每株菌可做2～3 次重复。 将以上96 孔板用封口膜密封，置于37 ℃培养箱中培养48 h， 依次观察每列各孔内颜色并做记录，分别与阳性对照第10 列和阴性对照第12 列进行比较，以不发生颜色变化的最低药物浓度为MIC值。 根据4 种抗生素对不同菌株MIC 值的范围，分别计算出各自能抑制50%分离菌株的最低浓度MIC50值和能抑制90% 分离株的最低浓度MIC90值。

1.2.5 M.bovis 对药物敏感性判断标准

判定结果参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）的指导方案评估对抗菌药物的耐药性或敏感性［8］，根据MIC 值将M. bovis 对所测药物的敏感性分为敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）和耐药（resistant，R），M.bovis 药物敏感性判定折点见表1。

表1 M.bovis 对部分抗菌药物敏感性判定折点单位：μg/mL

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度的测定结果

4 种抗生素最低抑菌浓度分布见图1～图4。通过对74 株M. bovis 药物敏感性分析， 结果显示，4 种抗生素呈不同程度的耐药性。 庆大霉素的MIC 值分布在＜4～512 μg/mL，MIC 呈U 形分布，MIC504 μg/mL，MIC90512 μg/mL，其中有34%的菌株敏感，30%的菌株中度敏感，36%的菌株产生耐药性。 大观霉素的MIC 值分布在＜4～512 μg/mL，MIC 也呈U 形分布，MIC50与MIC90分别为4 μg/mL 和256 μg/mL，有66%的菌株敏感，22%的菌株中度敏感，12%的菌株产生耐药性。 卡那霉素的MIC 值 分 布 在＜4 ～512 μg/mL， MIC508 μg/mL，MIC90512 μg/mL，有34%的菌株敏感，30%的菌株呈中度敏感，36%的菌株产生耐药性。 恩诺沙星的MIC 值 分 布 在＜4 ～128 μg/mL， MIC50＜4 μg/mL，MIC9016 μg/mL，61%的菌株MIC 值＜4 μg/mL，22%的菌株对其产生了耐药性。 恩诺沙星的MIC 分布范围最小，MIC50与MIC90值也最小，其次是大观霉素、庆大霉素和卡那霉素；试验菌株对大观霉素的耐药率最低（12%），其次为恩诺沙星（22%），对庆大霉素和卡那霉素的耐药率最高且相同（36%）。

图1 庆大霉素最低抑菌浓度分布

图2 大观霉素最低抑菌浓度分布

图4 恩诺沙星最低抑菌浓度分布

2.2 不同样本分离株最低抑菌浓度测定结果

4 种抗生素对不同样本分离的M.bovis 最低抑菌浓度结果见表2。 通过对肺组织（n=35）、乳汁（n=18）、关节液（n=21）分离株的药物敏感性分析和卡方检验对比，结果显示，各组间的MIC 差异不显著。 肺和关节液分离株的MIC 分布范围接近，且MIC50基本相同， 乳汁分离株的MIC 分布范围最小，MIC50和MIC90也最小。

表2 不同样本分离株最低抑菌浓度MIC50 和MIC90 的测定结果 单位：μg/mL

3 讨论

近年来，随着我国养牛业的迅速发展，异地运输已成为牛生产必不可少的环节， 虽然可以提高生产效率， 但也给动物疫病的扩散与传播埋下隐患［8］。由于国内外均无有效的M.bovis 商用疫苗或其他相关疫苗预防该病， 只能通过加强饲养管理和抗生素治疗进行有效防控。 但由于抗菌药物的不合理应用， 不同国家和地区的M.bovis 分离株已对临床常用药物呈现出不同程度的耐药性，给该病原引发疾病的治疗造成了困扰［9］。

该研究针对宁夏地区分离鉴定的74 株M.bovis 进行常用药物敏感性检测，以期优化临床治疗和用药方案。试验结果表明，分离株的耐药谱相同，74 株M.bovis 均对庆大霉素、 大观霉素、卡那霉素、恩诺沙星呈现出不同程度的耐药性，尤其对庆大霉素、卡那霉素的耐药性最强，两类药物的MIC 值呈U 形分布， 有逐渐增强的趋势， 这与Soehnlen 等［10］和Sulyok 等［11］的 检 测 结 果 基 本 一致。 值得注意的是， 尽管分离株对恩诺沙星最敏感，但对其耐药率也达到了22%，该结果介于有些研究人员在以色列和日本的检测结果（M.bovis 耐药率分别为26%和12%）［12-13］。 在肺、乳汁、关节液分离株的药物敏感试验中发现， 分离株均表现出相似的敏感性。 关节液分离株和肺分离株间的MIC50和MIC90十分接近，这也与Soehnlen 等［10］发现关节液分离株和肺部分离株在恩诺沙星的敏感性水平上没有显著差异是一致的。 乳汁分离株的MIC 值范围最小，MIC 值也最小， 说明其对4 种抗生素均相对敏感，耐药性相对最低。 肺分离株的MIC 值最大， 说明可能与呼吸道感染M.bovis概率大且频繁使用抗生素有关。 综上所述，在恩诺沙星、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素中，体外抑菌效果最好的是氟喹诺酮类药物恩诺沙星，其次是氨基糖苷类药物大观霉素，但恩诺沙星较大观霉素更易产生耐药性，在使用时应注意用药剂量和时长， 而M.bovis 对另外2 种氨基糖苷类药物庆大霉素和卡那霉素的敏感性一般且耐药性更强。