石青青，孙珊珊，李丽琴，宋秀梅，于海超，程雪娇，王 建

（天津市中升挑战生物科技有限公司，天津 300380）

粒细胞集落刺激因子 （granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）是一种多效细胞因子，主要通过与效应细胞表面的特异性受体结合发挥作用［1］。 G-CSF 参与粒系细胞的增殖和分化［2］，通过刺激生长因子的释放促进血管的形成［3］。G-CSF还能增强中性粒细胞的趋化、 吞噬和杀伤作用，在机体抗应激等方面发挥重要作用。 研究表明，G-CSF 具有抗炎、抗细胞凋亡、刺激神经元生成的作用［4-5］。

重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhGCSF）是运用基因重组技术生产的与G-CSF 具有相似生物学活性的一种重组蛋白［6-7］。 目前，rhGCSF 在临床上已被广泛应用。 rhG-CSF 是常见的干细胞动员剂［8］，在免疫调节［9］、骨髓移植、肝肾移植、骨髓抑制化疗［10］中表现出积极作用，对缺血性脑梗死［11］、急性髓性白血病［12］、慢性中性粒细 胞 减 少［13］、急 性 口 腔黏膜 炎［14］、急 性 辐 射综 合征［15］等具有一定的疗效。 此外，rhG-CSF 还可与抗生素联合使用防治感染。 聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子（pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，PEG-rhG-CSF）是rhG-CSF 与聚乙二醇交联得到的，与rhG-CSF相比，半衰期更长，作用更加持久，并且生物稳定性更强，可以减少临床使用中反复注射带来的不便［16-19］。

重组牛粒细胞集落刺激因子（recombinant bovine granulocyte colony stimulating factor，rbGCSF）是由rbG-CSF 重组大肠杆菌发酵纯化而来，目前在养殖业中未被使用。 初步评价其可能具有与rhG-CSF 相似的作用。 该研究对rbG-CSF 进行了发酵、纯化、鉴定，评价了其对小鼠的安全性，观察其对小鼠的毒性作用， 旨在为rbG-CSF 进一步的临床试验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

4 周龄左右体重18～22 g 的健康昆明系小鼠，272 只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物有限公司。 小鼠饲养于屏障环境，温度18～25 ℃，湿度40%～60%，定期饲喂标准鼠料，自由饮水。

1.1.2 菌株与试剂

rbG-CSF 重组大肠杆菌： 宿主菌为大肠杆菌BL21，表达载体pET-30a；保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号：CCTCC M 2017014；拉丁文分类名Escherichia coli BL21BG-CSF。

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、Na2HPO4·12H2O，购自天津渤化化学试剂有限公司；（NH4）2SO4，购自维科特（天津）化工产品贸易有限公司；NH4Cl，购自天津基准化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O、消泡剂、微量元素（MnSO4·5H2O、ZnCl2、CoCl·6H2O、Na2MO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、H3BO3、CaCl2·2H2O）、NaCl、Tween-80、NaAc、丙烯酰胺、bis丙烯酰胺、Tris，购自北京索莱宝科技有限公司；甘氨酸、SDS、甘油、溴酚蓝、巯基乙醇、乙醇、考马斯亮蓝R250， 购自国药集团化学试剂有限公司；尿素、K2HPO4、EDTA、冰乙酸，购自天津市鑫铂特化工有限公司；Triton X-100，购自Sigma-Aldrich 公司；BCA 法蛋白质浓度测定试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 仪器设备

10 L 发酵罐及控制柜BLBIO-10SJ、 冷水机BLBIO-LD600，上海百仑生物科技有限公司产品；卧式恒温振荡器IS-RDH2， 天津普瑞维亚科技有限公司产品；净化工作台SW-CJ-2F，浙江孚夏医疗科技有限公司产品； 静音无油空气压缩机AT80/38，江苏岱洛医疗科技有限公司产品；蒸发器TY9-0.7-D， 上海棠亿锅炉有限公司产品；Thermo 高速离心机LYNX4000， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；超声波破碎仪JY98-Ⅲdn，宁波新芝生物科技产品； 蛋白电泳系统Powerpac HC，BIO-RAD 产品； 凝胶成像分析系统SmartGel 600，北京赛智创业科技有限公司产品；紫外可见分光光度计UV-1900i，格泽尔机电设备贸易（天津）有限公司产品；往复式脱色摇床SH100，天津普瑞维亚科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 rbG-CSF 工程菌发酵、纯化及鉴定

依照孙珊珊等［20］的发明专利“一种重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌的高密度发酵的方法”，对rbG-CSF 工程菌进行发酵，获得发酵菌液。随后参照宋爽等［21］报道的新一代重组人粒细胞集落刺激因子纯化工艺对发酵所得的发酵液进行rbGCSF 的复性与纯化。纯化后的rbG-CSF 通过SDSPAGE 电泳方法对其纯化程度进行初步鉴定，判断与目标蛋白的匹配程度。 使用BCA 法蛋白浓度测定试剂盒对纯化的rbG-CSF 进行浓度测定，具体方法参考BCA 法蛋白浓度测定试剂盒说明书。

1.2.2 对小鼠的安全性评价

1.2.2.1 急性毒性试验

选取昆明系小白鼠112 只，雌雄各半，分为F组和J 组。 F 组为腹腔注射组，分为F1、F2、F3、D1组，每组14 只；J 组为肌肉注射组，分为J1、J2、J3、D2 组，每组14 只；D1、D2 组为空白对照组。 F1 组与J1 组小鼠注射300 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL（150 μg/只），F2 组与J2 组小鼠注射150 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL （75 μg/只），F3 组与J3 组小鼠注射75 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL （37.5 μg/只），D1组和D2 组小鼠注射生理盐水0.5 mL。最大剂量相当于重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子用量的500 倍。

给药后持续观察14 d，在此期间，每天观察小鼠的死亡情况和精神状态，每隔4 d 对小鼠称重1次。 给药后14 d 对各组小鼠进行剖检， 采集肝、脾、肾经HE 染色后进行病理组织学检查。

1.2.2.2 慢性毒性试验

选取昆明系小白鼠160 只，雌雄各半，分为T组和H 组。 T 组为腹腔注射组， 含T1、T2、T3、K1组， 每组20 只；H 组为肌肉注射组， 含H1、H2、H3、K2 组， 每组20 只，K1、K2 组为空白对照组。T1、H1 组小鼠注射150 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（15 μg/只），T2、H2 组 小 鼠 注 射100 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（10 μg/只），T3、H3 组每只小鼠注射50 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（5 μg/只），K1、K2组每只小鼠注射生理盐水0.1 mL，每周给药1 次，持续12 周。

每周注射后的第6 天对各组小鼠进行称重，观察各组小鼠死亡情况和精神状态，第12 周给药后7 d 对小鼠进行剖检，将肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和卵巢称重，计算脏器指数。 脏器指数=脏器质量（g）/体重（g）×100%。 采集肝、脾、肾经HE 染色后进行病理组织学检查。

1.2.3 数据处理

运用SPSS 20.0 统计学软件对小鼠体重、脏器系数进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 rbG-CSF 纯化与鉴定

2.1.1 SDS-PAGE 电泳结果

对纯化后的rbG-CSF 进行SDS-PAGE 鉴定。如图1 所示， 样品鉴定结果与预期的21.5 kDa 相符，说明纯化成功。

图1 rbG-CSF 蛋白纯化样品的SDS-PAGE 鉴定

2.1.2 rbG-CSF 浓度测定

依照BCA 试剂盒说明书提供的方法建立标准曲线y=2 339.1x-191.36，R2=0.999 3， 具体情况见图2。拟合度良好，在630 nm 下测得样品OD 的平均值为0.211，代入计算得到rbG-CSF 的浓度为302.19 μg/mL。

图2 rbG-CSF 浓度测定标准曲线

2.2 安全性评价

2.2.1 死亡情况

急性毒性试验中，rbG-CSF 腹腔注射组、rbGCSF 肌肉注射组、对照组均未出现死亡。 慢性毒性试验中，rbG-CSF 腹腔注射组T1 组在第1 周注射药物后1 d 死亡2 只；T3 组第1 周注射药物后1 d死亡1 只；T1、T2 组在第7 周注射药物后1 d 分别死亡1 只；T3 组在第10 周注射药物后1 d 死亡2只，试验期间共死亡7 只，肌肉注射组未见死亡，对照组K1 组在第6 周注射药物后1 d 死亡1 只。对死亡小鼠进行剖检，心脏、肝脏、脾脏、肺脏等内脏器官未见明显的病变。

2.2.2 体重变化

急性毒性试验观察期内小鼠体重变化情况见图3。 由图3 可知，腹腔注射组、肌肉注射组与相应的对照组相比， 小鼠体重增长趋势与对照组相比未见明显异常波动， 同时间段各组体重相差最大不超过2 g。 经统计学分析各组之间均无显著（P>0.05）差异。 慢性毒性试验观察期内，各时间段腹腔注射组、肌肉注射组与相应的对照组相比，无显著（P>0.05）差异。 由图4 可知，各组小鼠体重均平稳增长，未出现大的波动，最大变化幅度不超过4 g。

图3 急性毒性试验小鼠体重变化

图4 慢性毒性试验小鼠体重变化

2.2.3 脏器系数

慢性毒性试验12 周后测得的各组小鼠脏器系数见表1。 由表1 可知，腹腔注射和肌肉注射2种方式下，各剂量组雌、雄小鼠的肝、脾、肾和生殖器官的脏器系数均无显著（P>0.05）差异。

表1 慢性毒性试验小鼠脏器系数测定 单位：%

2.2.4 病理组织学检查

急性毒性试验14 d 与慢性毒性试验12 周后，分别对各组小鼠进行了解剖，取肝、脾、肾进行病理切片检查。 与对照组相比，毒性测试组（包括肌肉注射和腹腔注射的急性与慢性小组） 病理切片镜下观察发现，细胞结构完整，均未见明显的病理变化。图5 为腹腔注射最高剂量组与对照组肝、脾、肾的病理切片。

图5 毒性试验腹腔注射小鼠病理组织学观察（HE 染色，100×）

3 讨论

该研究纯化鉴定了一种重组牛粒细胞集落刺激因子， 验证了重组人粒细胞集落刺激因子工业化发酵、 复性以及纯化方法在rbG-CSF 上进行生产的可行性， 为将来rbG-CSF 规模化生产提供了技术参考。 采用BCA 试剂盒法测得蛋白浓度为302.19 μg/mL，满足了临床使用的需求，也为临床效果的评定提供了一定的支持。

目前，重组人粒细胞集落刺激因子的研究已经相当成熟，据报道，短效rhG-CSF 在机体内半衰期短并且稳定性差，容易引起免疫排斥等不良反应［22-23］。有关rhG-CSF 的临床评价显示，rhG-CSF 可能会影响肌肉骨骼系统，导致骨痛、肌肉疼痛；影响消化系统，导致呕吐、肝脏ALT 及AST 的升高；还可能引起眼炎症反应、体温升高、皮疹等［24］。

该研究对rbG-CSF 的安全性进行了初步的评价。体重作为非特异性观察指标［25-26］，能够综合反映机体的中毒状况，常被用作动物毒理研究的指标。 在对小鼠进行短期和长期注射rbG-CSF后，小鼠的体重变化在正常范围之内，试验组与对照组小鼠体重的增长并未出现较大的差距，说明该剂量水平上的rbG-CSF 对小鼠机体的毒性影响较小。

脏器系数可以反映受试药物对脏器毒性的综合情况， 是寻找受试物毒性作用靶器官的重要线索。 在研究中，排除体重变化对脏器系数的影响，可以用脏器系数旁证病理组织学的改变［27］。 该研究结果显示，持续注射rbG-CSF 12 周后，各试验组中的小鼠脏器系数与对照组相比均无显著差异，结合病理组织学检查，各试验组与对照组相比均未出现明显的病理变化，这说明，在该试验条件下，该剂量的rbG-CSF 可能并不能使小鼠肝、脾、肾及生殖器官发生器质性病理改变。

目前对于rbG-CSF 的研究尚不充分， 该研究对rbG-CSF 的临床评价起到一定的参考作用。 有关试验表明PEG-rhG-CSF 具有比rhG-CSF 更强的免疫细胞调节功能，并且长效，具有更易为临床使用者接受的特性［28］。研发PEG-rbG-CSF 也将是rbG-CSF 研究的一个重要方向。