贾如江，赵树山，尹清臣，刘秀丽，杨龙龙，温桂海

（邯郸市中心医院普一科，邯郸 056102）

微小染色体维持（minichromosome maintenance，MCM）蛋白家族广泛存在于真核生物细胞中，参与DNA复制前复合物的形成、DNA复制的起始及DNA的延长。由MCM2～MCM7这6个保守且高度同源的蛋白组成环形结构的亲水性六聚体复合物是真核细胞DNA复制前复合体的关键组分，与DNA复制的稳定性和准确性存在密切联系，是DNA复制与延伸所必需的。其功能失调可导致染色体缺陷，进而可能导致肿瘤的形成［1-2］。基于基因表达谱芯片的分析显示，MCM4可作为喉鳞状细胞癌的分子标志物［3］。胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一。本研究基于生物信息学方法分析MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌中的表达，分析其临床意义及其与预后的关系，以期为胰腺癌精准治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 在线数据库分析MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌中的表达

GEPIA数据库（gepia.cancer-pku.cn/）即基因表达谱数据动态分析，是由北京大学开发的在线数据库，可结合TCGA（The Cancer Genome Atlas，http://cancer.gov/）和GTEx（https://gtexportal.org）数据库分析基因在不同肿瘤中的表达情况。本研究利用GEPIA数据库在线分析MCM2、MCM4、MCM10的mRNA在胰腺癌与正常胰腺组织中的表达差异。HPA（Human Protein Atlas）数据库（http://proteinatlas.org/）可提供人类蛋白质的组织和细胞分布信息。本研究利用HPA数据库在线分析MCM2、MCM4、MCM10蛋白在胰腺癌中的表达，且从TCGA数据库中下载胰腺癌数据分析MCM2、MCM4、MCM10基因的表达与胰腺癌分期的关系。

1.2 在线数据库预后分析

利用GEPIA数据库分析MCM2、MCM4、MCM10基因的表达与胰腺癌患者的无病生存率（disease-free survival，DFS）、总生存率（overall survival，OS）的关系，以及胰腺癌中MCM2、MCM4、MCM10蛋白表达的相关性。利用HPA数据库在线检索MCM2、MCM4、MCM10在TCGA RNA标本库中的表达量，分析其RNA的表达与胰腺癌患者生存的关系。

1.3 String-DB数据库

String-DB数据库（https://string-db.org）是生物基因和蛋白质相互作用分析的检索平台，包含了已证实和可预测的蛋白-蛋白相互作用生物数据库，也包括了蛋白质之间间接功能的相关性。它除了包含有试验数据、从PubMed摘要中挖掘的结果和综合其他数据库数据外，还包括利用生物信息学的方法预测的结果。本研究在线数据库检索条件输入“MCM2、MCM4、MCM10”，物种选择“homo sapiens”，置信度选择“Medium 0.4”，相互作用选择连接数不超过10，最后进行检索。

1.4 Metascape进行富集分析

进一步采用Metascape数据库（https://metascape.org/）对MCM2、MCM4、MCM10及相关作用基因进行基因本体（gene ontology，GO）富集分析。

1.5 统计学分析

2 结果与分析

2.1 HPA数据库分析MCM2、MCM4蛋白的表达

HPA数据库中在线分析MCM2、MCM4、MCM10蛋白在胰腺癌中的表达。免疫组织化学分析结果显示：MCM2（抗体HPA031496）在11例胰腺癌中有2例高表达，6例中表达，1例低表达，2例阴性表达（图1）；MCM4（抗体HPA031496）在12例胰腺癌中有4例高表达，2例中表达，5例低表达，1例阴性表达（图2）。该数据库中未检测到MCM10在胰腺癌中的阳性表达。本研究对从TCGA数据库中下载胰腺癌数据进行了分析，其结果显示，MCM2、MCM4、MCM10的基因表达与胰腺癌分期无明显的相关性（P＞0.05）。

图1 MCM2在胰腺癌组织中的表达（免疫组化，100×）Fig. 1 MCM2 were expressed in pancreatic cancer tissue (immunohistochemical, 100×)（a）高表达；（b）中表达；（c）低表达；（d）阴性表达。(a) High expression; (b) Medium expression; (c) Low expression; (d) Negative expression.

图2 MCM4在胰腺癌组织中的表达（免疫组化，100×）Fig. 2 MCM4 were expressed in pancreatic cancer tissue (immunohistochemical, 100×)（a）高表达；（b）中表达；（c）低表达；（d）阴性表达。(a) High expression; (b) Medium expression; (c) Low expression; (d) Negative expression.

2.2 在线软件GEPIA数据库统计分析

根据在线GEPIA数据库的分析，纳入的179例胰腺癌组织和171例正常胰腺组织的对比结果显示，MCM2、MCM4、MCM10的表达差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 GEPIA分析MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达差异Fig. 3 GEPIA analysis of the differential expression of MCM2, MCM4, and MCM10 in pancreatic cancer tissues and normal pancreatic tissues（a）MCM2;（b）MCM4;（c）MCM10。 (a) MCM2; (b) MCM4; (c) MCM10.

2.3 在线数据库检测MCM2、MCM4、MCM10 mRNA与胰腺癌预后的关系

在GEPIA数据库中利用Kaplan-Meier法分析MCM2、MCM4、MCM10mRNA的表达水平与胰腺癌患者的DFS和OS的关系，结果提示，MCM2、MCM4、MCM10mRNA高表达组的胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PAAD）患者的DFS和OS（P＜0.005）均明显低于低表达组（图4）。为进一步分析MCM2、MCM4、MCM10mRNA的表达与胰腺癌患者远期预后的关系，本研究在HPA数据库中共分析了176例患者的胰腺癌组织，结果显示，MCM2、MCM4、MCM10mRNA的FPKM的平均表达数值为6.17、6.13、0.62；预后分析结果显示，当MCM2、MCM4、MCM10mRNA的表达节点的FPKM的平均表达数值分别设定为6.17 、6.13、0.62时，MCM2、MCM4、MCM10mRNA的表达与胰腺癌患者的预后存在明显的相关性，其高表达组相比较低表达组预后较差（P=0.00140，P=0.00024，P=0.00028）（图5）。

图4 GEPIA分析MCM2、MCM4、MCM10表达对胰腺癌患者的DFS和OS的影响Fig. 4 GEPIA analyzed the effects of different MCM2, MCM4, and MCM10 expression on the DFS and OS in pancreatic cancer patients（a）MCM2；（b）MCM4；（c）MCM10。 (a) MCM2; (b) MCM4; (c) MCM10.

图5 MCM2、MCM4、MCM10表达胰腺癌患者的总体生存曲线比较Fig. 5 Comparison of the overall survival curves for patients with pancreatic cancer expressing MCM 2, MCM4, and MCM10（a）MCM2；（b）MCM4；（c）MCM10。 (a) MCM2; (b) MCM4; (c) MCM10.

2.4 MCM2、MCM4、MCM10基因表达的相关性分析

利用GEPIA数据库分析胰腺中MCM2、MCM4、MCM10基因表达的相关性，结果显示，MCM2与MCM4（r=0.71）、MCM4与MCM10（r=0.71）、MCM2与MCM10（r=0.67）表达关系密切，具有明显的相关性，差异有统计学意义（图6）。

图6 GEPIA数据库分析胰腺癌中MCM2、MCM4、MCM10表达的关系Fig. 6 Analysis of MCM2, MCM4, and MCM10 expression relationship by the GEPIA database in pancreatic cancer（a）MCM2与MCM4的表达关系；（b）MCM10与MCM4的表达关系；（c）MCM2与MCM10的表达关系。（a）Expression relationship of MCM2 and MCM4; (b) Expression relationship of MCM10 and MCM4; (c) Expression relationship of MCM2 and MCM10.

2.5 String-DB数据库

蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI）富集分析结果显示（图7）：在PPI网络中，预测的与MCM2、MCM4、MCM10具有密切相互作用的蛋白有MCM5、MCM6、RPA3、RPA1、POLA2、ORC2、ORC3、DBF4、CDC6和GINS2（P＜1.0e-16）等。

图7 与MCM2、MCM4、MCM10相关的蛋白网络的分析Fig. 7 Analysis of the protein network associated with MCM2, MCM4, and MCM10

2.6 Metascape对MCM2、MCM4、MCM10及相关作用基因进行GO富集分析

利用Metascape数据库对MCM2、MCM4、MCM10及相关作用基因进行GO富集分析，发现其主要富集在前复制复合体的活化、DNA复制、DNA合成、DNA复制的启动、细胞核DNA的复制、CDC6相关的复制起点识别复合物、皮瓣转移、介导通路、体温自动调节通路等信号通路中。柱状图为top 8的显示富集的条目（图8）。

图8 MCM2、MCM4、MCM10及相关作用基因富集分析Fig. 8 Enrichment analysis of MCM2, MCM4, MCM10, and related role genes

3 讨论

胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的消化道恶性肿瘤之一［4-5］，其5年生存率不足10%［6］。近年来其发病率有明显的上升趋势。我国胰腺癌发病率居所有恶性肿瘤第10位，死亡率居第6位［7］。MCM家族包括MCM2～MCM10这9种进化高度保守的家族蛋白，是DNA复制过程中的通行证，可控制细胞周期从G1期向S期进展［8-9］，在复制起始过程中具有解螺旋酶的活性，在细胞周期内控制复制起始时间上具有重要作用［10］。MCM4是潜在的食管癌增殖的新型标志物［11］。MCM4、MCM6和MCM10的表达水平与肿瘤进展呈正相关关系［12-13］。MCM2、MCM4、MCM8和MCM10的过表达与胰腺癌的不良预后有关［14］。MCM家族在DNA复制与细胞周期进程和检查点调控结合等方面具有重要作用，有望成为胰腺癌治疗中的重要靶点［15］。

本研究通过在线数据库对MCM2、MCM4和MCM10进行检索，其结果充分表明，MCM2、MCM4和MCM10基因在胰腺导管腺癌中高表达，并且其高表达的胰腺癌患者预后较差。这预示MCM2、MCM4和MCM10可能能够成为胰腺癌新的预后标记物。

有趣的是，本研究检测到MCM2、MCM4蛋白在胰腺癌中高表达，但是未检测到MCM10在胰腺癌中表达，这一结果和基因表达层面不吻合，分析原因可能是与基因表达与蛋白生成之间会总受到相关因素干扰有关，需要我们进一步通过基础试验研究来寻找答案。本研究分析显示，MCM2、MCM4、MCM10基因表达与胰腺癌分期无明显相关性，原因可能是大数据库的病例收集入库存在一定的偏颇，下载的胰腺癌数据库中Ⅰ期病例和Ⅲ、Ⅳ期病例均较少，影响了分析结果的科学性。

胰腺癌具有间质成分较多的特性［16-17］。临床胰腺癌对化疗敏感性差，易出现耐药性。探索解决胰腺癌化疗耐药性是目前研究的热点问题［18］。有研究证明，减少过量的MCM复合物可以增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，通过下调MCM4部分降低MCM复合物，可增加胰腺癌细胞对吉西他滨和氟尿嘧啶的敏感性［19］。

本研究基因富集分析发现，MCM2、MCM4、MCM10及其密切作用的相关蛋白主要富集在前复制复合体的活化、DNA复制、DNA合成、DNA复制的启动、细胞核DNA的复制、CDC6相关的复制起点识别复合物、Flap连结的移除、体温自动调节通路等信号通路中。我们的研究认为，MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌中高表达，并且表达具有明显的相关性，三者构成MCM家族在胰腺癌中的主要成分，构成功能模块，通过前复制复合体的活化、DNA复制、DNA合成、DNA复制的启动、细胞核DNA的复制、CDC6相关的复制起点识别复合物等生物过程参与胰腺癌细胞的发生与发展，甚至可能影响胰腺癌耐药性的发生，从而影响胰腺癌患者的预后。MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌中功能模块的发现有望为胰腺癌的靶标治疗提供新的方向。

综上所述，本研究利用生物信息学数据库分析了MCM家族中MCM2、MCM4、MCM10在胰腺癌患者中的表达差异及其与胰腺癌患者预后的相关性，并推测其可能存在的作用机制，为胰腺癌的精准治疗提供了新的方向，但是仍需要进一步的试验研究证实，以期为胰腺癌的临床治疗提供新的靶点。