邓春燕,熊蓓蓓,彭 玲,徐敬根

(四川省成都市双流区第一人民医院肿瘤科 610200)

肾癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,易转移,转移性肾癌占初诊肾癌的20%～30%,迫切需要寻找新的靶点来诊断和治疗肾癌[1-2]。miRNA具有原癌基因或抑癌基因的作用,参与多种细胞生物学过程；circRNA可竞争性吸附miRNA,作为miRNA海绵参与多种基因的表达调控,在肿瘤发生发展中发挥重要作用[3-4]。研究报道circ_001895通过调控miR-296-5p/SOX12促进肾透明细胞癌进展[5]。此外miR-296-5p可抑制食管鳞状细胞癌的肿瘤细胞的侵袭和迁移[6]。敲除circ_0000512通过调节miR-296-5p/RUNX1轴抑制细胞增殖并促进结直肠癌细胞凋亡[7]。Circular RNA Interactome生物学软件预测发现miR-296-5p与circ_0081143有结合位点。circ_0081143是由COL1A2剪切而成的circRNA,位于chr7:94044537-94055169；研究报道circ_0081143在胃癌组织中上调,circ_0081143沉默抑制了胃癌发生并增强了胃癌细胞对顺铂的敏感性[8]。circCOL1A2沉默通过增强miR-29b的表达来抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞的增殖、迁移、血管生成[9]。而circ_0081143对肾癌细胞786-O生物学过程的影响尚不清楚。本实验旨在研究circ_0081143对肾癌细胞786-O生物学过程的影响及其机制是否与miR-296-5p有关。

1 材料与方法

1.1 材料

选取本院2017年1月至2021年1月37例肾透明细胞癌患者术中切除的肾癌组织及其配对癌旁正常组织,标本均经病理检查确诊,患者年龄23～72岁,平均(56.1±5.3)岁。患者术前未进行过放化疗,且对本研究均知情同意。

1.2 细胞与试剂材料

肾癌细胞786-O购自上海启达生物科技有限公司；RPMI-1640培养基购自武汉益普生物科技有限公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；MTT试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell小室购自北京明阳科华生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自艾美捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1细胞处理与分组

肾癌细胞786-O常规培养于RPMI-1640培养基中,将circ_0081143小干扰RNA1、2、3转染786-O细胞后检测circ_0081143表达水平,选择表达水平最低的小干扰RNA用于后续试验。

将circ_0081143小干扰RNA及阴性对照、miR-296-5p模拟物及阴性对照转染至786-O细胞,记为si-circ_0081143 组、si-NC组、miR-296-5p mimic组、miR-NC组；将circ_0081143小干扰RNA与miR-296-5p抑制剂共转染至786-O细胞,记为si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor组。

1.3.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0081143和miR-296-5p的表达水平

提取肾癌组织、癌旁组织及各组786-O细胞的总RNA,合成cDNA,按照试剂盒说明进行PCR,相对表达量用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH和U6为内参,circ_0081143上游引物序列：5′-GCAGGAGGTTTCGGCTAAGT-3′,下游引物序列：5′-GCAACAAAGTCCGCGTATCC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC-3′,下游引物序列：5′-GTGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′；miR-296-5p上游引物序列：5′-TGCCTAATTCAGAGGGTTGG-3′,下游引物序列：5′-CTCCACTCCTGGCACACAG-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.3双荧光素酶报告实验

将circ_0081143野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-296-5p共转染至786-O细胞中,按照说明书检测荧光素酶活性。

1.3.4MTT检测细胞增殖抑制率

各组786-O细胞培养48 h,每孔分别加入MTT溶液20 μL,孵育4 h后每孔加入二甲基亚砜150 μL,振荡反应10 min,酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.5克隆形成实验检测细胞克隆形成数

各组786-O细胞消化后制成细胞悬液,以每孔100个细胞接种于6孔板,培养2周出现肉眼可见克隆时终止培养,细胞清洗2遍后用甲醇固定15 min,然后用结晶紫染色30 min,低倍光学显微镜下计数大于50个细胞的集落。

1.3.6Transwell小室法检测迁移细胞数

将各组786-O细胞在无血清的培养液中饥饿12 h,取100 μL细胞悬液加入Transwell上室,培养24 h,取出Transwell小室,甲醇固定30 min,0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,PBS清洗3遍,风干后在显微镜下随机选取5个视野观察细胞,并记数。

1.3.7流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组786-O细胞,用预冷的PBS清洗2次,加入结合缓冲液重悬,再加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,混匀、避光孵育10 min；上流式细胞仪检测。

1.3.8蛋白质印迹法检测蛋白表达

提取各组786-O细胞的总蛋白,经SDS-PAGE分离蛋白,转膜、封闭,加入cleaved-caspase3一抗4 ℃孵育过夜,再加入二抗室温孵育2 h,曝光显影,定影,分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 circ_0081143和miR-296-5p在肾癌中的表达

与癌旁组织相比,肾癌组织中circ_0081143表达水平升高,miR-296-5p表达水平降低(P<0.05),见表1；circ_0081143小干扰RNA1、2、3转染肾癌细胞786-O后circ_0081143表达水平均降低(1.00±0.00vs.0.35±0.03/0.21±0.02/0.28±0.04)，差异有统计学意义(F=1 648.811,P<0.05)。

表1 肾癌组织中circ_0081143和miR-296-5p表达的检测

2.2 circ_0081143和miR-296-5p靶向关系的验证

circ_0081143和miR-296-5p有互补序列(图1)；miR-296-5p与circ_0081143野生型报告质粒共转染后细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)；而miR-296-5p与circ_0081143突变型报告质粒共转染后细胞荧光素酶活性无显著变化(表2)。si-circ_0081143组(1.00±0.00)miR-296-5p表达水平高于si-NC组(2.74±0.19)，差异有统计学意义(t=27.474,P<0.05)。

图1 circ_0081143和miR-296-5p的互补序列

表2 双荧光素酶报告实验

2.3 circ_0081143和miR-296-5p对786-O增殖的影响

与si-NC组相比,si-circ_0081143组786-O细胞抑制率升高,克隆形成数减少(P<0.05)；与miR-NC组相比,miR-296-5p mimic组786-O细胞抑制率升高,克隆形成数减少(P<0.05)；与si-circ_0081143 组相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor组786-O细胞抑制率降低,克隆形成数增加(P<0.05),见图2,表3。

图2 circ_0081143和miR-296-5p对786-O克隆形成的影响

表3 circ_0081143和miR-296-5p对786-O细胞抑制率和克隆形成数的检测

2.4 circ_0081143和miR-296-5p对786-O迁移的影响

与si-NC组相比,si-circ_0081143组786-O迁移细胞数减少[164.00±6.71)个vs.(64.50±1.80)个],差异有统计学意义(P<0.05)；与miR-NC组相比,miR-296-5p mimic组786-O细胞迁移细胞数减少[(167.63±9.51)个vs.(84.50±2.4)个],差异有统计学意义(P<0.05)；与si-circ_0081143 组相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor组786-O迁移细胞数增加[(64.50±1.80)个vs.(140.63±6.54)个],差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

图3 circ_0081143和miR-296-5p对786-O迁移细胞数的影响

2.5 circ_0081143和miR-296-5p对786-O凋亡的影响

与si-NC组相比,si-circ_0081143组786-O细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水平升高(P<0.05)；与miR-NC组相比,miR-296-5p mimic组786-O细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水平升高(P<0.05)；与si-circ_0081143 组相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor组786-O细胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达水平降低(P<0.05),见图4,表4。

A：circ_0081143和miR-296-5p对786-O凋亡率的影响；B：circ_0081143和miR-296-5p对786-O中cleaved-caspase3蛋白表达的影响。

表4 circ_0081143和miR-296-5p对786-O凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表达的检测

3 讨 论

靶向治疗在肾癌治疗中起重要作用,在肾癌的姑息性治疗和术前辅助治疗方面均获得了显著的疗效[10]。因此,研究肾癌的发生发展机制寻找更多的靶点以开发新的靶向药物对肾癌治疗具有重要意义。研究表明circRNA参与调控肿瘤的发生发展过程,如敲低circ_0081143减轻了缺氧诱导的胃癌细胞迁移、侵袭和上皮/间质转化[11]。为研究circ_0081143对肾癌细胞的影响,本实验先检测了肾癌组织中circ_0081143表达水平,结果显示,肾癌组织中circ_0081143高表达,提示circ_0081143可能在肾癌中起促癌作用。本实验进一步沉默circ_0081143后,786-O细胞抑制率升高,克隆形成数和迁移细胞数减少,786-O细胞凋亡率升高,表明沉默circ_0081143可抑制786-O细胞增殖和迁移,并促进细胞凋亡。

研究报道miR-296-5p在乳头状甲状腺癌组织和细胞中的表达水平显著下调,miR-296-5p模拟物可抑制乳头状甲状腺癌细胞增殖、抑制细胞克隆形成并诱导细胞凋亡[12]。miR-296-5p过表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。本实验结果显示,肾癌组织中miR-296-5p表达水平降低,提示miR-296-5p可能在肾癌中起抑癌基因作用。且过表达miR-296-5p后,786-O细胞抑制率升高,克隆形成数和迁移细胞数减少,786-O细胞凋亡率升高；表明过表达miR-296-5p可抑制786-O细胞增殖和迁移,并促进细胞凋亡。

研究报道circPLK1敲低通过调节miR-296-5p抑制了三阴性乳腺癌体外细胞生长和侵袭及体内肿瘤的发生和转移[14]。circ_0000515通过调节 miR-296-5p/CXCL10 轴影响乳腺癌的进展[15]。表明circRNA可通调控miR-296-5p影响肿瘤进展。本实验通过Circular RNA Interactome生物学软件预测发现miR-296-5p与circ_0081143有结合位点。且通过双荧光素酶报告实验证实circ_0081143可靶向调控miR-296-5p,而抑制miR-296-5p表达逆转了沉默circ_0081143对786-O细胞的影响。

综上所述,沉默circ_0081143通过上调miR-296-5p抑制肾癌细胞786-O的增殖和迁移,促进细胞凋亡。