朴松哲 郑兰 王鑫 何浩辉 柯莽

前列腺癌（prostate cancer,PCa）是男性常见的恶性肿瘤之一。据2021年全球统计数据报告，PCa发病率居男性恶性肿瘤的第一位[1]。尽管PCa早期患者的治愈率有所提高，但转移或复发PCa，特别是去势抵抗性 PCa（castration resistant prostate cancer,CRPC）患者的预后仍较差。目前，免疫疗法在癌症治疗中被广泛应用。研究发现，PCa的肿瘤微环境表现为免疫抑制，因此免疫疗法在转移性PCa中的临床获益有限[2]。除派姆单抗被美国FDA批准用于高微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）和高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden,TMB）晚期实体肿瘤治疗外，Sipuleucel-T疗法仍是美国FDA批准的唯一用于转移性PCa的免疫疗法。因此，探索一种能预测肿瘤免疫治疗反应性的生物标志物和新的免疫治疗靶点是该领域的研究热点。PDLIM2基因位于人8号染色体（8p21.2）上，是辅肌动蛋白相关LIM蛋白超家族成员之一，参与细胞增殖、细胞迁移、细胞极化、细胞间连接的调节以及上皮间质转化、免疫细胞识别等过程[3]。近来研究发现，PDLIM2参与免疫调节过程，在肿瘤发生、发展过程中起重要作用[4]。相关研究报道，下调PDLIM2表达能明显抑制CRPC样癌细胞生长和侵袭能力[4-6]。然而，目前关于PDLIM2在PCa中的表达及其与临床病理特征、预后的关系尚不清楚。因此，本文利用生物信息学技术分析PDLIM2对PCa预后的影响，并深度挖掘其基因功能，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 数据获取 利用UCSC Xena数据库（http://www.xebabrowser.net）下载癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）PCa的3级RNA序列数据、突变数据、临床病理参数和生存期数据。

1.2 表达差异分析 利用R软件（V4.0.3）limma、ggplot2程序包分析PCa组织与癌旁正常组织中PDLIM2 mRNA表达水平的差异。

1.3 表达验证 利用UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）中的TCGA模块比较PCa组织与癌旁正常组织中PDLIM2 mRNA表达水平及其启动子区域甲基化水平，并进一步根据患者Gleason评分、分子亚型进行分层分析。TCGA将PCa分为7个分子亚型，包括ERG融合、ETV1融合、ETV4融合、FLI1融合、SPOP突变、FOXA1突变、IDH1突变。利用HPA数据库（https://www.proteinatlas.org）比较不同级别PCa组织中PDLIM2蛋白表达水平的差异，分析PDLIM2在细胞内的定位。

1.4 生存分析 对TCGA的PCa RNA-seq数据进行单因素Cox回归分析，比较PDLIM高、低表达（以PDLIM2 mRNA表达水平的中位数为界值）组患者总生存期（overall survival,OS）和无进展生存期（progression free survival,PFS）。

1.5 PDLIM2共表达基因富集分析 使用Linked Omics数据库（http://www.linkedomics.org/login.php）的 Link Finder模块分析PCa队列（479例）中与PDLIM2相关的差异表达基因，采用Spearman秩相关分析方法。使用Linked Omics数据库的Link Interpreter模块对差异表达基因进行通路和网络分析，采用基因本体富集分析法。

1.6 PDLIM2与肿瘤免疫细胞浸润程度、TMB、MSI、免疫检查点（immune checkpoint，ICP）基因表达及肿瘤干性评分的相关性分析 利用Sanger Box数据库查询“PDLIM2”，采用TIMER算法分析PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平。利用基因模块分析PDLIM2 mRNA表达水平与肿瘤免疫细胞（包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞）浸润程度、TMB、MSI、ICP基因表达及肿瘤干性评分之间的相关性，采用Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 PCa组织与癌旁正常组织中PDLIM2 mRNA表达水平的差异 利用TCGA数据分析发现，PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平明显低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 PDLIM2表达验证和相关分析 利用UCLCAN数据库验证发现，与癌旁正常组织相比，PCa组织中PDLIM2 mRNA 表达水平较低（P＜0.05），见图 1a（插页）；而PDLIM2启动子区域甲基化水平较高（P＜0.05），见图1b（插页）。基于TCGA数据库分析PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平与Gleason评分、分子分型的关系，结果显示Gleason评分9分者PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平明显高于6、7分者（均 P＜0.05），见图1c（插页）；与癌旁正常组织比较，ERG融合、ETV1融合、SPOP突变者PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平均明显下调（均P＜0.05），其中SPOP突变者较ERG融合者PDLIM2 mRNA表达水平明显上调（P＜0.05），见图1d（插页）。HPA数据库分析发现细胞中PDLIM2主要定位于细胞肌动蛋白丝，黏附位点，见图1e（插页）。免疫组化结果显示，随PCa组织级别的升高，PDLIM2的染色强度明显增强，见图1f（插页）。

图1 PDLIM2表达水平与PCa患者不同临床病理学参数的关系和细胞定位结果（a：PCa组织与癌旁正常组织中PDLIM2 mRNA表达水平比较；b：PCa组织与癌旁正常组织中PDLIM2启动子区域甲基化水平比较；c：不同Gleason评分患者PCa组织中PDLIM2mRNA表达水平比较；d：不同分子亚型患者PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平比较；e：PDLIM2细胞定位；f：不同级别PCa组织中PDLIM2蛋白表达的免疫组化染色所见）

2.3 生存分析 利用TCGA数据分析发现，在PCa患者中，PDLIM2高表达者PFS明显短于PDLIM2低表达者，差异有统计学意义（P＜0.05）；而 PDLIM2高、低表达者OS比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 PDLIM2共表达基因富集分析 使用Linked Omics的功能模块分析479例PCa患者在TCGA中的mRNA测序数据，结果显示PDLIM2与12 198个基因呈正相关，与7 852个基因呈负相关，见图2a（插页）；热图分析显示，PDLIM2 mRNA表达与TSPAN4、LGALS1、GAS6、GYPC、LYL1 基因均呈正相关（rs=0.76、0.74、0.73、0.73、0.73，均 P＜0.05），与 SMARCC1、HOOK1、ZNF24、DNAJC16、FOXA1基因均呈负相关（rs=-0.65、-0.62、-0.62、-0.61、-0.61，均 P＜0.05），见图 2b-c（插页）。与PDLIM2相关的基因主要富集在胶原代谢过程、整合素介导的信号通路、体液免疫反应、白细胞迁移、IFN-γ产生、血管生成、急性炎症反应等生物学过程。

图2 PDLIM2共表达基因富集分析结果（a：火山图，绿色所示为下调基因，红色所示为上调基因；b：与PDLIM2呈负相关的前50个基因的热图；c：与PDLIM2呈正相关的前50个基因的热图）

2.5 PDLIM2与肿瘤免疫细胞浸润程度、TMB、MSI、ICP基因表达及肿瘤干性评分的相关性 PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润程度均呈正相关（r=0.24、0.39、0.12、0.29、0.49、0.44，均 P＜0.05）；与 TMB、MSI均呈正相关（均 r＞0，均 P＜0.05）；与 38个 ICP基因表达均呈正相关（均 r＞0，P＜0.05）；与肿瘤干性评分呈正相关（r=0.16，P＜0.05）。

3 讨论

目前关于PDLIM2在肿瘤中的作用仍存在争议。有文献报道PDLIM2能够调节乳腺上皮细胞极性，是抑制乳腺癌发生、发展的关键机制[7]。体外和体内实验证实，上调PDLIM2表达可抑制乳腺癌细胞非锚定生长[8]。Sun等[9]报道了PDLIM2在肺癌中受表观遗传抑制，并与程序性死亡受体1抑制剂治疗的耐药性和不良预后有关。而维生素D可直接上调PDLIM2表达，从而诱导乳腺浸润癌细胞中PDLIM2启动子区域的去甲基化[10]。以上结果均提示PDLIM2具有抑癌作用。然而，在雄激素非依赖性PCa细胞株DU145中PDLIM2表达明显上调，而抑制PDLIM2表达可抑制肿瘤细胞侵袭能力。此外，雄激素敏感的PCa细胞与CRPC样癌细胞中的PDLIM2表达水平存在明显差异。在雄激素敏感的PCa细胞中，PDLIM2过表达能抑制肿瘤细胞的增殖能力；在CRPC样癌细胞中，PDLIM2高表达能促进细胞增殖、恶性转化和上皮间质转化过程[7]。以上研究结果说明PDLIM2同时具有促癌和抑癌作用，其作用可能与肿瘤类型和细胞环境等因素有关。此外，PDLIM2可能是PCa潜在的治疗靶点。

本研究利用TCGA数据分析显示，PDLIM2在PCa组织中呈低表达，且PCa组织中PDLIM2启动子区域甲基化水平高于癌旁正常组织；生存分析结果显示，PDLIM2高表达的PCa患者PFS更短。Song等[11]报道PDLIM2启动子甲基化可下调PDLIM2 mRNA表达水平，与本研究结果一致。本研究结果发现，PDLIM2 mRNA表达水平随Gleason评分增高而升高，与Gleason 6、7分患者比较，Gleason 9分患者PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平明显较高。HPA数据库的免疫组化分析结果显示，PDLIM2主要定位于细胞肌动蛋白丝，黏附位点；且随着PCa组织级别的升高，PDLIM2蛋白染色强度明显增强。这说明PDLIM2 mRNA表达水平与PCa组织分级有关，可能参与PCa发生、发展过程。本研究还分析了PCa中与PDLIM2共表达基因的生物学功能，结果显示PDLIM2共表达基因主要富集在胶原代谢过程、整合素介导的信号通路、体液免疫反应、白细胞迁移、IFN-γ产生、血管生成、急性炎症反应等生物学过程。研究发现，PDLIM2作为肿瘤抑制因子，通过抑制肿瘤相关基因，增加参与抗原呈递和T细胞启动，说明PDLIM2在PCa中可能参与免疫微环境调节[12]。

TIMER数据库结果显示，PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞浸润程度均呈正相关。从理论上分析，具有高TMB、MSI的肿瘤患者对ICP抑制剂具有更高的敏感性。此外，ICP基因的高表达被广泛作为免疫治疗反应的预测因子。本研究发现，PCa组织中PDLIM2 mRNA表达水平与TMB、MSI和ICP基因表达均呈正相关，说明PDLIM2可能是肿瘤免疫治疗效果的潜在预测因子。2021年美国国家综合癌症网络指南在M1期CRPC全身治疗中考虑新增TMB检测，并提出帕博丽珠单抗用于高MSI或错配修复缺陷（different mismatch repair,dMMR）或TMB≥10 mut/Mb的M1期CRPC患者。但目前关于TMB在PCa免疫治疗中的预测价值结果并不一致，可能与TMB算法不同有关[13]。Abida等[14]发现在1 033例转移性CRPC患者中，有32例表现为高MSI，其中11例接受基于ICP抑制剂的治疗，近半数患者前列腺特异抗原水平下降幅度＞50%。Schweizer等[15]基于小样本研究发现，10例PCa导管内癌患者中有4例为dMMR，其中3例患者具有高MSI特征；值得注意的是，其中1例dMMR/高MSI患者在使用派姆单抗治疗期间，前列腺特异抗原水平明显降低。以上结果说明PDLIM2高表达的PCa患者可能对免疫疗法更加敏感，可能从免疫治疗中获益，但仍需作进一步研究证实。此外，PCa组织中PDLIM2表达水平与肿瘤干性评分呈正相关，说明PDLIM2可能促进PCa肿瘤干性特征的表达，促进肿瘤发展。Dai等[16]研究发现，PCa的TME与其干细胞性呈负相关。Miranda等[17]研究发现，肿瘤细胞干细胞可影响TME的免疫应答，从而导致肿瘤异质性。以上结果提示在PCa中，PDLIM2可能通过免疫调节来影响肿瘤细胞干性。

综上所述，PDLIM2可能成为评估PCa预后的生物标志物和肿瘤免疫治疗的新靶点。但本研究结果是基于生物信息学技术分析的，仍需进一步动物实验和临床试验进行验证。