潘烽平 李彦 张明明

据2018年全球癌症统计数据报告，每年因结直肠癌（colorectal cancer,CRC）死亡超过 700 000例[1]。在我国，多数CRC患者确诊时已经处于进展期，对于这部分患者，目前的手术和辅助治疗效果有限且不良反应较大[2-3]，患者预后欠佳[4]。因此，深入了解CRC发生及发展的分子机制至关重要。正常细胞主要依靠线粒体的氧化磷酸化供能，而肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下，依然优先通过有氧糖酵解途径来提供能量，该现象称为 Warburg效应[5]。研究表明，癌基因、抑癌基因在肿瘤有氧糖酵解过程中发挥重要作用[6]，例如在胰腺癌中，UHRF1通过转录抑制SIRT4来促进肿瘤细胞的有氧糖酵解和增殖[7]；在CRC中，B7-H3调控HK2来促进肿瘤细胞的有氧糖酵解和化疗抵抗，从而影响患者的预后[8]。同源盒蛋白（homeobox protein,HOX）B5是一种新型转录因子，参与细胞增殖和分化的调控。相关研究表明，HOXB5参与人类多种恶性肿瘤的发生、发展过程，例如在胰腺癌中，HOXB5通过激活GSK3β/β-catenin通路来促进肿瘤细胞增殖转移和侵袭[9]；在雌激素受体阳性的乳腺癌中，HOXB5能促进肿瘤细胞增殖和转移[10]；在CRC中，HOXB5的高表达与患者远处转移、高临床分期和预后不良呈正相关[11]。但尚无研究证明HOXB5是否能通过调节CRC细胞代谢来参与癌变过程。因此，本研究就HOXB5对CRC细胞有氧糖酵解和恶性增殖的影响作一探讨，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养 人 CRC细胞株（SW480、Lovo、Caco2、HCT116）购自中国科学院上海细胞库。将细胞株置于含10%FBS的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2的条件下培养。每1～2 d使用胰蛋白酶消化传代1次，保持细胞活力，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2 细胞选择 内源性HOXB5蛋白表达水平在Caco2细胞中最低，在 SW480、Lovo细胞中次之，在HCT116细胞中最高，见图1。故本实验选择Caco2细胞用于过表达实验，HCT116细胞用于敲低实验。

图1 HOXB5在CRC细胞系中表达的电泳图

1.3 细胞转染 过表达HOXB5的质粒、敲低HOXB5的质粒、对照质粒均购自苏州吉玛公司。将细胞（3×104个/孔）均匀接种至24孔板内，待细胞生长融合度约70%时，按照Lipofectamine 2000说明书步骤将目的质粒、对照质粒转染细胞。转染培养48 h后，收集细胞用于实验研究。

1.4 HOXB5对CRC细胞增殖能力影响的检测 采用CCK-8法。将细胞（3×103个/孔）铺在96孔板中培养，每24 h测定一次细胞活力。每次测量时加入10 μl CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h，然后使用分光光度计测量每个样品波长450 nm处的吸光度（OD450）值。每组测量3孔，取平均值。

1.5 HOXB5对CRC细胞平板克隆形成能力影响的检测 采用平板克隆实验。将细胞（4×104个/孔）接种至6孔板中，并在含10%FBS的培养基中培养2周。甲醇固定菌落，结晶紫染色，采集图像并计数平板克隆形成数。

1.6 HOXB5对CRC细胞有氧糖酵解影响的检测（1）葡萄糖消耗量检测：按照葡萄糖检测试剂盒说明书，将细胞（3×104个/孔）接种至96孔板中，常规培养，生长过夜。第2天将培养基移除，PBS清洗3次，加入100 μl无葡萄糖的培养基（含 150 μg/ml的 2-NBDG溶液），培养适当时间。移除上清液，加入200 μl cellbased Assay Bufffer溶液，369 r/min 离心 5 min；移除上清液，加入 200 μl cell-based Assay Bufffer溶液，立即上机检测。（2）乳酸含量检测：按照乳酸检测试剂盒说明书，将1×106个细胞溶于100 μl乳酸检测缓冲液中，12 000 r/min离心10 min，移除杂质、过滤掉乳酸脱氢酶后，取10 μl加入96孔板中，加入适量乳酸检测缓冲液调节体积至50 μl；再加入50 μl反应工作液至96孔板中充分混匀，室温、避光孵育30 min；使用荧光分光光度计检测。（3）ATP含量检测：按照ATP检测试剂盒说明书，将2×106个细胞溶于100 μl ATP检测缓冲液中，12 000 r/min离心11 min，吸取上清液后，取11 μl加入96孔板中，加入适量ATP检测缓冲液调节体积至52 μl。再加入50 μl反应工作液至96孔板中充分混匀，室温、避光孵育30 min；使用荧光分光光度计检测。

1.7 HOXB5对CRC细胞糖酵解相关蛋白影响的检测 采用Western blot法。将细胞平铺在6孔板中，待细胞融合度达到75%时，用 PBS洗涤细胞并用 RIPA裂解液裂解。然后将裂解物置于冰上进行超声处理，4℃、13 000 r/min离心5 min，去除细胞碎片。经过蛋白浓度测定、蛋白变性等步骤制作蛋白样品。将样品在12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（30 μg/泳道）中溶解并转移至聚偏氟乙烯膜上。在4℃下，使用适当抗体探测膜过夜。洗涤3次后，将膜置于辣根过氧化物酶标记的二抗中室温下孵育2 h；采用增强化学发光法显示蛋白质条带。实验中使用到的抗体有丙酮酸激酶同工酶 2（pyruvate kinase isoenzyme,PKM2）抗体（1∶1 000）、乳酸脱氢酶 A（lactate dehydrogenase A,LDHA）抗体（1∶1 000）、葡萄糖转运蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT1）抗体（1∶1 000），均购自英国 Abcam 公司。

1.8 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXB5对CRC细胞增殖能力的影响 在Caco2细胞中，过表达HOXB5能明显增强细胞增殖能力（P＜0.05）；在HCT116细胞中，敲低HOXB5能明显减弱细胞增殖能力（P＜0.05），见图 2。

图2 HOXB5对CRC细胞增殖能力的影响（a：过表达HOXB5对Caco2细胞增殖能力的影响，*P＜0.05；b：敲低HOXB5对HCT116细胞增殖能力的影响，*P＜0.05）

2.2 HOXB5对CRC细胞平板克隆形成能力的影响在Caco2细胞中，过表达HOXB5能明显增强细胞平板克隆形成能力（P＜0.05）；在HCT116细胞中，敲低HOXB5能明显减弱细胞平板克隆形成能力（P＜0.05），见图3。

图3 HOXB5对CRC细胞平板克隆形成能力的影响（a：过表达HOXB5对Caco2细胞平板克隆形成能力的影响，*P＜0.05；b：敲低HOXB5对HCT116细胞平板克隆形成能力的影响，*P＜0.05）

2.3 HOXB5对CRC细胞有氧糖酵解的影响 在Caco2细胞中，过表达HOXB5能明显增加细胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均P＜0.05）；在HCT116细胞中，敲低HOXB5能明显减少细胞葡萄糖消耗量以及乳酸、ATP含量（均 P＜0.05），见图 4。

2.4 HOXB5对CRC细胞糖酵解相关蛋白的影响在Caco2细胞中，过表达HOXB5能明显上调PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表达水平（均 P＜0.05）；在 HCT116细胞中，敲低 HOXB5能明显下调 PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表达水平（均P＜0.05），见图5。

图5 过表达或敲低HOXB5后CRC细胞糖酵解相关蛋白表达的电泳图

3 结论

在恶性肿瘤的发展过程中，整个代谢网络在癌基因、抑癌基因主导下发生“重编程”，而营养物质在代谢网络中的流向和流量被重新定义。相较于正常细胞，癌细胞内葡萄糖摄取和糖酵解速率明显增加，高速糖酵解能快速产生ATP，不再偶联线粒体氧化代谢，产生的丙酮酸大多数由乳酸脱氢酶催化，在细胞质基质中转化为乳酸。即使在氧气充足支持氧化磷酸化的情况下，恶性肿瘤细胞仍青睐糖酵解作为主要产能途径，这种糖代谢的“重编程”是癌细胞的一个显著特征，该现象被称为 Warburg效应或有氧糖酵解[12]。体内外实验证实，有氧糖酵解对于多种恶性肿瘤细胞的增殖至关重要，可能是联系恶性肿瘤细胞能量代谢与促增殖表型的一个普遍机制[13]。

越来越多研究表明，HOX家族在人类恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，且参与肿瘤细胞异常代谢的过程。研究表明，HOXC9调节鼻咽癌细胞糖酵解过程，并促进肿瘤的进展[14]。此外，也有研究证实HOXB5参与胰腺癌[15]、头颈部鳞癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]等多种肿瘤的癌变过程。在CRC中，HOXB5高表达是患者肿瘤复发和预后的一个独立危险因素。在机制方面，HOXB5过表达可通过反式激活CXCR4、ITGB3来促进CRC转移[11]。然而，目前尚无研究探讨并明确HOXB5能否通过调节CRC有氧糖酵解过程来参与癌变过程。本研究结果显示，过表达HOXB5可以明显增强Caco2细胞增殖及平板克隆形成能力，增加Caco2细胞葡萄糖消耗量以及糖酵解产物乳酸和ATP含量，上调糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA和GLUT1蛋白表达水平；而敲低HOXB5可以明显减弱HCT116细胞增殖及平板克隆形成能力，减少HCT116细胞葡萄糖消耗量以及糖酵解产物乳酸、ATP含量，下调糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA、GLUT1蛋白表达水平。

综上所述，本研究证实HOXB5通过促进CRC细胞有氧糖酵解来增强其恶性增殖。但关于HOXB5调控有氧糖酵解的具体分子机制有待进一步研究明确。