李明磊，孟令建，杜薇薇，王军

徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221002

早产儿脑损伤是早产儿生后常见的神经系统疾病，严重时可遗留脑性瘫痪、视力损害、癫痫、智力和学习障碍等后遗症，给医疗、社会和家庭带来沉重的负担。目前，早产儿脑损伤可供选择的治疗方法非常有限，成为困扰临床医生的难题之一。维生素D是体内调节钙磷代谢的一类脂溶性维生素，人类大脑各个部位均存在维生素D 受体和维生素D 合成途径的关键酶，是神经组织发育和发挥功能的重要组成部分［1］。Th17/Treg 细胞水平失衡被认为是脑损伤后发生炎症反应的一个重要原因［2］。研究显示，维生素D可以通过调节Th17/Treg细胞比例，降低脑损伤后的急性炎症反应［3］。在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）小鼠模型中，通过补充维生素D 可提高抗炎因子IL-10、IL-4、TGF-β 水平，减少促炎因子IL-17、IL-6、TNF-α 生成，纠正Th17/Treg 细胞失衡，抑制损伤后的神经炎症反应，从而降低EAE 的严重程度［4］。此外，维生素D 对多发性硬化症、创伤性脑损伤、缺血性脑卒中等多种神经损伤后的炎症反应也具有相似的调节作用［5-6］。本研究通过观察脑损伤早产儿生后不同时间点血清25-（OH）D 的变化，探讨其水平变化与炎症反应的相关性，为临床防治早产儿脑损伤提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2019 年8 月—2021 年8 月在徐州医科大学附属医院出生、生后24 h内入住NICU且存活的53 例早产儿，男29 例、女24 例。纳入标准：①出生胎龄≤34 周；②具有脑损伤高危因素：脑缺氧缺血与血流动力学紊乱，如严重宫内窘迫与出生时窒息、高或低碳酸血症等；血液系统疾病，如凝血功能异常、贫血、红细胞增多症等；产科高危因素，如血栓或羊水栓塞、孕期并发症及不良嗜好、异常分娩史等。③临床资料完整。排除标准：由严重先天发育畸形、遗传代谢紊乱、宫内TORCH感染、生后严重感染性疾病、复杂型先天性心脏病、严重低血糖以及高胆红素血症等原因所引起的脑损伤。两组早产儿均于出生后7 d开始口服维生素D 制剂800 IU/d，3个月后改为口服维生素D制剂400 IU/d，并建议服用至2岁［7］。于生后第1、3、7天各做1次颅脑超声检查，以后每周复查1次，于纠正胎龄36～40周完善头颅MRI 检查。颅脑超声和（或）头颅MRI 检查出现各种类型颅内出血（如脑室周围—脑室内出血、蛛网膜下腔、小脑、脑实质等部位出血）、脑室周围白质软化、脑梗死等表现之一者即确诊为脑损伤。根据影像学检查结果，将早产儿分为观察组24 例、对照组29 例。观察组男15 例、女9 例，胎龄（31.6 ± 2.2）周，出生体质量（1655.0 ± 500.0）g，1 min Apgar 评分5.0（3.3，6.8）分，5 min Apgar 评分（6.0 ± 1.8）分，孕母年龄（30.3±5.8）岁；对照组男14 例、女15例，胎龄（32.0 ± 2.1）周，出生体质量（1704.1 ±414.8）g，1 min Apgar 评分6.0（4.0，6.0）分，5 min Apgar 评分（6.5 ± 1.6）分，孕母年龄（30.9 ± 7.4）岁。两组患儿性别、胎龄、出生体质量、1 min及5 min Apgar 评分、孕母年龄比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。本研究获得徐州医科大学附属医院伦理委员会审核通过，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 血清25-（OH）D 及炎症指标IL-17、IL-10 检测 采集两组出生后第1、7、14天桡动脉血1.5 mL，置于肝素抗凝管保存，30 min 内检测。4 ℃下3000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），取上层血清，采用ELISA 法检测血清25-（OH）D、IL-17、IL-10 水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒均购自上海将来实业股份有限公司。血清25-（OH）D 水平＞20 ng/mL为正常，15～20 ng/mL为不足，＜15 ng/mL为缺乏［8］。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。通过Shapiro-Wilk法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以-x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验，各时间点血清25-（OH）D、IL-17、IL-10 水平比较采用重复测量方差分析。因本研究中各指标均不满足球形度检验（P＜0.05），故关注多变量检验，因交互效应存在差异（P＜0.05），进一步行简单效应分析，采用LSD 法进行两两比较。采用Pearson 相关分析血清25-（OH）D与IL-17、IL-10水平的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生后第1天血清25-（OH）D水平比较 对照组生后第1 天血清25-（OH）D 水平正常1 例，不足14例，缺乏14例；观察组第1天25-（OH）D 水平缺乏24 例。观察组血清25-（OH）D 缺乏患儿比例高于对照组（P＜0.05）。

2.2 两组不同时间点血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比较 观察组第1、7、14天血清25-（OH）D 水平均低于同期对照组，IL-17 水平均高于对照组，IL-10水平在第1、7 天低于对照组，第14 天高于对照组（P均＜0.05）。两组血清25-（OH）D 水平在生后第7 天均较第1 天下降，第14 天水平逐渐上升，高于第1、7天（P均＜0.05）。观察组血清IL-17 水平第7 天高于第1天，第14天较第7天降低（P均＜0.05）；血清IL-10水平第7天较第1天降低，第14天较第7天升高（P均＜0.05）。对照组血清IL-17 水平在第7、14 天均低于第1 天（P均＜0.05），第14 天与第7 天比较差异无统计学意义（P＞0.05）；血清IL-10水平在第7天低于第1天，第14天低于第7天（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组不同时间点血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比较（±s）

表1 两组不同时间点血清25-（OH）D、IL-17、IL-10水平比较（±s）

注：与观察组相同时间点比较，*P＜0.05，与同组第1 天比较，△P＜0.05；与同组第7天比较，▲P＜0.05。

组别观察组第1天第7天第14天对照组第1天第7天第14天n 242925-（OH）D（ng/mL）12.23±2.0911.10±2.49△18.96±4.10△▲15.64±1.96*13.71±2.53*△21.99±2.99*△▲IL-17（pg/mL）25.99±3.6132.44±5.50△23.89±8.40▲20.14±2.49*17.20±3.44*△15.64±3.28*△IL-10（pg/mL）8.81±1.927.41±2.25△13.79±3.52△▲13.10±1.84*11.43±1.98*△9.30±3.22*△▲

2.3 观察组不同时间点血清25-（OH）D 水平与IL-17、IL-10 水平的相关性 观察组第1、7、14 天血清25-（OH）D 水平与IL-17 水平均呈负相关（r分别为-0.894、-0.585、-0.642，P均＜0.05）；第1、7 天血清25-（OH）D 水平与IL-10 水平呈正相关（r分别为0.655、0.599，P均＜0.05），第14 天与IL-10 水平无明显相关性（P=0.266）。

3 讨论

早产儿因其大脑发育不成熟，在缺氧窒息、感染等多重因素作用下，易发生各种出血性和（或）缺血性损伤。近年来，国内外在早产儿脑损伤治疗方面已进行了大量研究，如促红细胞生成素、亚低温治疗、褪黑素、脐血干细胞、人羊膜干细胞等疗法均取得一定进展，但在临床上使用仍存在一定的争议。在一项涉及345 例急性创伤性脑损伤患者的单中心研究中，轻中度脑损伤患者在损伤急性期维生素D水平显著降低；肌注10 万IU 维生素D 后，患者的行为和认知能力得到明显改善［9］。研究表明，维生素D 主要通过影响神经细胞分化、增加神经营养因子表达、调节细胞内钙信号传导、抑制神经炎症反应、清除氧自由基以及促进神经递质合成等多种途径发挥神经保护作用［10］。维生素D在治疗脑损伤方面展现出了一定的潜力，通过补充维生素D 治疗和预防早产儿脑损伤已得到较多学者的关注。LOWE 等［11］报道，在50 例中重度新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）患儿中，超过70%存在维生素D不足，认为HIE可能增加25-（OH）D 的消耗，生后低水平的维生素D 可能是导致HIE 加重的影响因素。MCGINN 等［12］报道，低水平维生素D 与HIE 早期不良结局及脑损伤严重程度有关。本研究结果显示，两组早产儿生后第1 天25-（OH）D 普遍较低，对照组第1 天25-（OH）D不足和缺乏各14例，而观察组第1天25-（OH）D普遍缺乏。进一步分析显示，观察组血清25-（OH）D水平在生后各时间点均低于对照组；即使从生后第7 天开始补充800 IU/d 的维生素D3，至生后第14 天仍有部分早产儿不能达到正常水平。这可能与母亲孕期维生素D贮备不足［13］以及脑损伤后消耗增多有关。在脑损伤小鼠模型中，损伤后的炎症反应消耗了25-（OH）D，大约在第11天血清25-（OH）D水平降至最低点［14］。

神经炎症在继发性损伤以及组织修复中发挥重要作用，Th17/Treg细胞比例失衡是脑损伤后炎症反应发生的重要原因。IL-17 主要由Th17 细胞产生，病理情况下由外周进入中枢参与诱导神经炎症反应；IL-10 是Treg 细胞分泌的一种抗炎因子，对Th17细胞有负向调节作用。脑损伤发生后，损伤局部释放损伤相关的分子模式（DAMPs），如高迁移率组蛋白1、活性氧、过氧化物还原蛋白等，通过激活TLR2/TLR4 诱导小胶质细胞产生IL-23，进而增加IL-17 在小胶质细胞和其他免疫细胞中的表达，而IL-17 主要通过NF-κB、MAPK/AP-1、C/EBP 等信号通路产生神经炎症反应［15］。IL-17 通过刺激神经胶质细胞产生趋化因子，招募中性粒细胞进入中枢神经系统，激活基质金属蛋白酶水解内皮细胞紧密连接蛋白破坏血脑屏障，DAMPs 通过破损的血脑屏障进入外周循环，激活多种细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞等）向脑实质迁移和浸润［16-17］，从而形成恶性循环。IL-17 还能增加凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax 表达，通过增加脑损伤后Bax/Bcl-2 比例，启动神经元凋亡程序［18］，进一步加重脑损伤。本研究结果显示，观察组血清IL-17 水平在生后各时间点均高于对照组，IL- 10 水平在第1、7 天低于对照组；而第7 天补充维生素D后，第14天血清IL-10水平升高、IL-17水平下降。提示早产儿脑损伤发生早期存在明显的炎症反应，而25-（OH）D 可能通过调节损伤后血清IL-17/IL-10水平参与抗炎过程。

维生素D 可以阻断NF-AT、Runx1、ERK/MAPK和PI3K/mTOR 相关信号通路，间接抑制IL-17生成，也可通过维生素D受体直接影响IL-17水平，并减少Th17 细胞上趋化因子受体的表达，来阻止其迁移至中枢；同时，维生素D 可减少促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、RANKL、COX-2 的生 成，通 过上 调Foxp3 促进Treg 细胞诱导生成IL-10，参与脑损伤后的抗炎过程［19］。IL-10 可直接抑制Th17 细胞产生IL-17，也能通过IL-10 受体的信号传导增强Treg 细胞抑制IL-17生成的能力，而Treg细胞的抑制能力似乎也与血清25-（0H）D 水平相关［20］。本研究通过相关性分析发现，观察组各时点25-（OH）D 水平与IL-17 水平均呈负相关，第1、7 天血清25-（OH）D 水平与IL-10 水平呈正相关。以上进一步说明25-（OH）D 可能对IL-17/IL-10水平具有一定的调节作用，通过早期补充维生素D 抑制损伤后的炎症反应可能是治疗早产儿脑损伤的一个潜在途径。

综上所述，脑损伤早产儿生后各时间点血清25-（OH）D 水平均较低，且其水平变化与炎症因子IL-17、IL-10 存在一定的相关性；25-（OH）D 可能通过影响IL-17/IL-10 水平抑制脑损伤后的炎症反应。考虑到维生素D 具有价格低廉、群众接受性好等特点，并且在公共卫生上也具有一定的意义，因此建议临床医生应加强对新生儿生后维生素D 水平的监测，进一步展开维生素D 与早产儿脑损伤之间关系的相关研究。本研究的不足之处在于，首先未能收集母亲孕期的营养状况；其次研究样本量小；因伦理限制无法设置维生素D 空白对照组，也没有进行后续的随访；再次早产儿作为一个特殊群体，提供神经保护所需维生素D 的剂量和水平尚不清楚，还需相关的基础及临床试验进一步研究。