刘岩松，张洁，卢涛

北京中医药大学生命科学学院，北京 102488

随着全球人口老龄化的加剧，衰老相关疾病不断增加。轻度认知障碍（MCI）是正常认知老化和痴呆之间的过渡阶段，研究表明，患有MCI的老年人每年以10%～30% 的速度发展为阿尔茨海默症（AD）［1］，并且约66.7%的AD 患者合并营养不良［3］。营养不良与老年期认知障碍和衰退、阿尔茨海默病、轻度认知障碍相关［3］。神经退行性疾病所造成的认知功能下降、生活能力缺失等症状对患者及其家庭造成严重困扰，由疾病继发的营养不良状况还可能导致疾病恶化。研究显示，疾病相关营养不良症状（DRM）可导致抗氧化分子和线粒体耗氧量的减少［4］。DRM 者体内炎症因子和促氧化剂分子上升，破坏了线粒体功能，打破氧化剂—抗氧化剂平衡，细胞生物大分子经历严重的氧化损伤，最终导致细胞活力下降［5-6］。光生物调节（PBM）是指红光或近红外光（波长600～1100 nm）在低剂量照射下，直接作用组织而引起的自我保护反应。与医疗中常见的激光治疗不同，PBM 不是一种烧蚀或热机制，而是光被生物体吸收后产生的一种类似于植物光合作用的光化学效应。目前PBM 的作用机制尚不清楚，可能与细胞色素C 氧化酶（CCO）有关。CCO 是电子传递链的末端酶，在光谱的红色和近红外区域中充当光感受器和光信号传感器，介导电子从细胞色素C 到分子氧的转移［7］。PBM 通过增加电子传递链中复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性，从而改善线粒体功能，提高细胞活力。2021 年5 月—12 月，我们通过构建人神经母细胞瘤细胞营养缺乏模型，观察660 nm 波长红光照射对细胞活力的调节作用，并探讨PBM 对线粒体的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与光源 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。可调直流稳压电源FPS-306D 购自于广州市飞马电器有限公司，光宏660 nm波长LED芯片、20 mm铝基板购自深圳新星源光电有限公司。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）购自以色列Biological Industries 公司；青—链霉素溶液、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；细胞增殖—毒性检测试剂CCK-8、线粒体膜电位荧光探针（JC-1）、DCFH-DA 活性氧（ROS）荧光探针购自北京兰博利德商贸有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；7-AAD 染色液购自美国Biolegend公司。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱（美国NUAIRE），高速离心机（美国Thermo），长时程动态活细胞成像及功能分析系统Incucyte S3（美国Essen Bioscience），流式细胞仪（美国BD），酶标仪（美国BioTek）。

1.2 细胞培养 取SH-SY5Y 细胞，加入含15%FBS、1%青—链霉素溶液的RPMI1640 培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，至细胞融合度约为90%时，按照1∶3 的比例进行传代培养。

1.3 营养缺乏细胞模型制备 取对数生长期细胞接种于96 孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。弃去培养液，将细胞随机分为营养缺乏组和正常营养组，分别加入低营养培养基（RPMI 1640 培养基中加入终体积5% FBS 和1%青—链霉素溶液）、正常培养基（RPMI 1640 培养基中加入终体积15% FBS和1%青—链霉素溶液）200 μL，置于培养箱中孵育24 h。采用CCK-8 法检测细胞活力，使用酶标仪测量450 nm 以及参比波长650 nm 处的光密度（OD）值，计算细胞活力。结果显示，营养缺乏组和正常营养组的细胞活力分别为0.66 ± 0.04、1.00 ± 0.06，营养缺乏细胞活力较正常营养组降低（P＜0.01），表明营养缺乏细胞模型制备成功。

1.4 LED 光照装置搭建 取6 颗波长为660 nm的LED 芯片，用硅酮导热膏将其固定在直径20 mm 的铝基板上，再将铝基板固定于6 孔板板盖。在板盖上过每个孔的圆心做孔板长、短边的平行线，其相交于6 点，每个点即为LED 芯片铝基板的固定位置。LED 芯片之间使用串联方式连接，最后将导线与直流稳压电源正负极连接（图1）。为使光源更均匀地照射细胞，细胞放置于光源上方约2.7 cm 处。

图1 直流稳压电源与LED芯片连接示意图

1.5 最佳光照参数筛选 取对数生长期细胞，以2×104/孔接种于96 孔板，置于培养箱中孵育24 h。弃去培养液，加入低营养培养基200 μL 孵育24 h。将细胞随机分为5组，在室温环境下，分别给予能量密度为2、4、8、16 J/cm2的660 nm 红光照射1 h；另设空白对照组，室温环境下避光孵育1 h。采用CCK-8试剂检测细胞活力。重复上述步骤，依次使用2、4、8 mW/cm2功率密度的660 nm 红光照射，以细胞活力最高组对应的功率密度和能量密度作为最佳光照条件。

1.6 细胞数量动态监测 使用实时动态活细胞成像系统监测细胞增殖情况。取对数生长期细胞，以2×104/孔接种于96 孔板，置于培养箱中孵育24 h。弃去培养液，加入低营养培养基200 μL 孵育24 h。将细胞随机分为两组，光照组在最佳光照条件下接受红光照射1 h，对照组在相同环境下避光孵育1 h。光照结束后，使用Incucyte 实时动态活细胞成像系统每2 h 拍照1 次，连续监测24 h。由Incucyte 内置算法计算细胞汇合度，细胞汇合度=每个孔内细胞投影面积/孔面积，用来衡量细胞数量。以0 h 为基准进行标准化处理，计算光照后8、16、24 h时各组细胞平均汇合度，以此反映细胞数量。

1.7 线粒体膜电位检查 使用荧光探针JC-1 检查线粒体膜电位。取JC-1 粉末加入DMSO 混匀，制成5 mg/mL 的储存液，使用前以不含血清的RPMI1640培养基将其稀释成10 μg/mL 的工作液。取对数生长期细胞，以6×105/孔接种至7 块6 孔板（光照组6块孔板，对照组1 块孔板），置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。弃去培养液，加入低营养培养基200 μL 孵育24 h。光照组6 块孔板分别在最佳光照参数下照射1、2、3、4、5、6 h，对照组在相同环境下避光孵育1 h。光照结束后将细胞放回培养箱中继续孵育1 h。向各孔加入胰酶消化，300 g 离心5 min，收集细胞，加入200 μL JC-1 工作液37 ℃孵育15 min；300 g 离心5 min 弃上清，用无血清培养液洗涤细胞2次，使用DPBS重悬细胞。流式细胞仪上样检测，525 nm 激发，选择PE 通道检测分析，490 nm激发，选择FITC 通道检测分析。当线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集于线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1 仍为单体，不能聚集，产生绿色荧光。因此红色/绿色荧光强度比值可用于衡量线粒体功能，当红色/绿色荧光强度比值降低时提示线粒体功能下降。

1.8 细胞内ROS 水平检测 取对数生长期细胞，以6×105/孔接种至7 块6 孔板（光照组6 块孔板，对照组1块孔板），按照“1.7”的方法进行分组、光照处理。向细胞中加入胰酶消化，300 g 离心5 min，收集细胞，加入DCFH-DA 工作液200 μL，吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min。用无血清培养液洗涤2 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；使用DPBS重悬细胞，加入5 μL 7-AAD 染色液，室温孵育5 min。流式细胞仪上样检测，488 nm 激发，选择FITC-A 和PerCP-Cy5通道检测分析。因7-AAD 无法透过正常细胞膜，但可透过坏死细胞的细胞膜，进入细胞内对DNA 进行染色，产生强烈荧光，从而鉴定出死细胞；荧光探针DCFH-DA 自身无荧光，其穿过细胞膜进入细胞后被水解为DCFH，细胞内的ROS将无荧光的DCFH 氧化生成带有荧光的DCF，故以DCF的荧光水平代表细胞内ROS水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 660 nm 红光对营养缺乏细胞的最佳光照条件筛选结果 见表1。在功率密度为2 mW/cm2、能量密度为8 J/cm2时，光照组细胞活力最高（P＜0.01）。因此将功率密度2 mW/cm2、能量密度8 J/cm2作为最佳光照条件，进行后续实验。

表1 不同光照参数下营养缺乏SH-SY5Y细胞活力（±s）

表1 不同光照参数下营养缺乏SH-SY5Y细胞活力（±s）

功率密度（mW/cm2）0 2 2 2 2 4 4 4 4 8 8 8 8能量密度（J/cm2）0 2 4 8162 4 8162 4 816细胞活力1.00±0.061.12±0.031.15±0.041.22±0.060.98±0.021.02±0.090.95±0.141.05±0.081.01±0.090.84±0.030.90±0.050.88±0.040.90±0.02

2.2 660 nm 波长红光对SH-SY5Y 细胞数量的影响 见表2。光照组光照8、16、24 h 后，细胞汇合度与对照组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表2 两组不同时间点的细胞汇合度比较（±s）

表2 两组不同时间点的细胞汇合度比较（±s）

注：与对照组比较，P均＞0.05。

组别光照组对照组细胞汇合度8 h 1.09±0.041.10±0.0316 h 1.16±0.061.15±0.0424 h 1.16±0.061.16±0.05

2.3 660 nm 波长红光对SH-SY5Y 细胞线粒体膜电位的影响 对照组及光照组1、2、3、4、5、6 h 细胞线粒体膜电位红色/绿色荧光强度比值分别为1.00 ±0.02、1.11 ± 0.01、1.13 ± 0.02、1.13 ± 0.02、1.40±0.49、1.03±0.01、0.97±0.00。光照组随光照时间延长，线粒体膜电位水平逐渐升高；与对照组相比，光照后1 h 后开始上升（P＜0.05），2、3 h 时上升到平台期（P＜0.01），4～6 h时回落（P＞0.05）。

2.4 660 nm 波长红光对SH-SY5Y 细胞内ROS 水平的影响 对照组及光照组1、2、3、4、5、6 h 细胞内ROS 水平分别为1.00 ± 0.01、0.90 ± 0.01、0.87 ±0.02、0.83 ± 0.02、1.15 ± 0.02、0.96 ± 0.00、1.12 ±0.01。光照组随光照时间延长，ROS 水平逐渐降低；与对照组相比，光照1、2 时降低（P均＜0.05），3 h 时降至最低（P＜0.01），4、6 h 时升高（P＜0.05或＜0.01），5 h时无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

在神经退行性疾病进程中，部分患者由于认知障碍导致营养摄入不均衡，而营养元素缺乏会对其病情产生不利影响［8］，在细胞层面上表现为代谢活动降低，进而引起细胞活力下降，甚至细胞凋亡［9］。目前临床上普遍通过营养风险筛查和评估对患者状况进行诊断与分级，制定不同的治疗策略。常见的营养补充方法为口服营养补充剂，用来补充营养素（蛋白质、碳水化合物、脂肪酸）和微量营养素（维生素、矿物质）。而PBM 作为一种光疗法，通过将特定波长的单色光施加到病变部位，促进组织修复，降低炎症水平，从而达到治疗效果。最初关于PBM 的研究主要集中于创面愈合，例如PBM 可加速牙髓手术后早期阶段的软硬组织愈合，并降低患者疼痛感［10］；随着研究的逐渐深入，人们发现PBM 能够促进脑血液代谢，降低炎症和氧化应激水平，改善衰老过程中大脑的认知障碍［11］。动物实验显示，使用660 nm 红光经颅照射D 半乳糖诱导的衰老小鼠大脑时，可调节线粒体功能、ROS产生和神经元凋亡，从而改善小鼠的认知障碍［12］。PITZSCHKE 等［13］报道，用脑室照明代替经颅照明，可将光传输到深部大脑的效率提高20倍，使用671 nm波长红光可以照射到深部脑组织，使PBM 在临床应用成为可能。本研究采用波长660 nm 的LED 芯片作为光源，从细胞底部进行照射，对于贴壁细胞来说，最大程度减少了光反射次数，降低了能量损耗。

PBM 所使用的光源在红色或近红外光谱中通常具有窄光谱宽度，功率密度为1～5000 mW/cm2。光照参数在PBM 中起到决定性作用，不同波长、能量密度、功率密度均可对细胞和组织产生不同作用，或有助于组织修复，或对组织无显著影响，或有害于细胞造成组织损伤［14］。ROJAS 等［15］研究发现，PBM可增加活体大鼠前额叶皮质活性，当能量密度在10.9 J/cm2时，细胞活力增加14%，21.6 J/cm2时增加10%，而32.9 J/cm2时细胞活力增加3%。本研究使用不同光照参数照射营养缺乏SH-SY5Y 细胞，发现在功率密度为2 mW/cm2、能量密度为8 J/cm2条件下，660 nm 红光照射使细胞活力显著升高；而在功率密度为4 mW/cm2时，细胞活力无明显变化；在功率密度为8 mW/cm2时，660 nm 红光对细胞活力有轻微抑制作用，但差异无统计学意义；在能量密度为16 J/cm2时，不论功率密度多寡，对细胞活力均无促进作用。以上数据表明，功率密度可能是660 nm红光PBM 效应的首要影响因素，过高的功率密度可能对细胞存在抑制作用，而能量密度对细胞活力的调节作用较小，并且在2 mW/cm2功率密度下能量密度与细胞活力可能存在倒U 型剂量效应，低剂量表现为促进效应，高剂量表现为抑制效应。

CCK-8 试剂可用于简便而准确的细胞活力分析，其原理是电子耦合试剂WST-8 可以被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜产物，其颜色深浅与线粒体脱氢酶活性、数量成正比。当细胞线粒体功能不变时，细胞活力上调可以反映为细胞数量的增加；当细胞数量不变时，细胞活力上调意味着线粒体功能的增强。本研究通过Incucyte 长时程活细胞成像技术监测细胞汇合度变化进而判断细胞数量，结果显示，光照组光照后8、16、24 h的细胞汇合度与对照组比较差异均无统计学意义，这意味着PBM 是通过增强线粒体功能而不是通过增加细胞数量来上调细胞活力的。

线粒体功能障碍是几乎所有疾病的标志。一部分疾病由线粒体基因组DNA的获得性或遗传性突变产生；另一类疾病则是由其他因素引起的线粒体损伤，最终会导致细胞能量抑制，其特征是胞质磷酸化电位降低，从而抑制控制细胞内Ca2+稳态及其氧化还原状态的能力［16］。本研究使用荧光探针JC-1检测线粒体膜电位，观察营养缺乏SH-SY5Y 细胞接受光照后线粒体膜电位的变化，结果显示，光照后膜电位开始上升，并随时间延长逐渐升高，提示线粒体膜电位发生超极化，在2 h和3 h达到最高；此后膜电位逐渐回落，提示线粒体功能恢复至光照前水平。光照后线粒体膜电位变化表明，660 nm 红光照射能在短时间内增强营养缺乏SH-SY5Y细胞的线粒体功能。

ROS主要来源于线粒体，其作为信号分子，能够调节NF-κB转录活性、介导细胞自噬过程，参与多种信号通路的传导［17-18］。当ROS 过量或出现在错误的地方时会造成细胞损伤［19］，因此ROS 水平直接决定了其对细胞内稳态的作用。本研究结果显示，营养缺乏SH-SY5Y 细胞在接受光照后，活细胞中的ROS水平逐渐下降，在3 h时降至最低点，随后开始上升，在4、5、6 h 三个时间点ROS 水平均不低于对照组。这表明660 nm 红光照射可以在短时间内降低细胞ROS 水平，改善体内氧化应激状态；但随着时间增加，ROS水平又出现上升，这可能是由于光照后短期内线粒体膜电位发生超极化进而加快呼吸链中电子传递，在电子从还原电位低的地方向还原电位高的地方传递时，电子会在呼吸链底物端和氧端漏出，进而产生ROS，因此存在一定的滞后效应［20］。

综上所述，在功率密度为2 mW/cm2、能量密度为8 J/cm2时，波长660 nm 红光照射对营养缺乏SH-SY5Y 细胞活力有促进作用；660 nm 红光能够快速超极化线粒体膜电位、降低ROS 生成，从而增强线粒体功能。