于章龙，赵智勇，刘 瑞，宋 昱，谢飒英，蔡 岳，孙元琳

(1.山西农业大学棉花研究所/省部共建有机旱作农业国家重点试验室(筹)，山西运城 044000；2.运城学院生命科学系，山西运城 044000)

黑小麦指籽粒颜色为黑、紫等色的小麦品种，属于优质特色谷物资源。与普通小麦相比，黑小麦含有更加丰富的膳食纤维、酚酸、花色苷、B 族维生素和硒、锌、铁等微量元素以及多种活性物质，以其特殊的营养价值而备受关注。研究表明，黑小麦籽粒硒含量高达0.2 mg·kg左右，属于富硒谷物。硒是生物体必需的微量元素，也是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，它可以缓解机体因为自由基引起的氧化性损伤，对机体的生长发育、免疫机能和抗氧化性有重要作用。硒在植物体内以无机硒和有机硒形态存在，有机硒在植物体内存在的形式主要有硒蛋白、硒多糖和硒核酸等，较无机硒更易被人体吸收。探讨富硒黑小麦硒的存在形态、各组分含量、抗氧化能力及其之间的关系，能够为充分开发和利用富硒黑小麦提供理论基础。本研究以运黑14207为原料，在分离提取蛋白质、多糖和核糖组分的基础上，利用原子荧光光度法检测各组分中的硒含量，并分析各组分清除自由基的能力，以确定运黑14207中有机硒的主要赋存形态及其抗氧化活性，为其功能食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试黑小麦品种运黑14207，由山西农业大学棉花研究所选育并提供。

1.2 方 法

1.2.1 原料预处理

参考李娟等的方法并稍作修改。用自来水将运黑14207籽粒洗净，用去离子水冲洗，50～55 ℃烘干麦粒表面水分，用3100型波通小麦粉碎仪磨粉制备全麦粉。

称取小麦粉100 g于烧杯中，加入200 mL丙酮脱脂，磁力搅拌2 h后抽滤，重复3次；将脱脂全麦粉置于干燥器内备用。

1.2.2 硒含量测定

籽粒硒含量及各组分中硒含量测定均参照GB 5009.93-2010荧光法。

1.2.3 不同蛋白组分提取

参考赵萍等方法，采用累进提取法提取水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白；参考李甜等方法提取碱溶性蛋白；并稍作修改。

水溶性蛋白提取:准确称取脱脂全麦粉10.0 g于烧杯中，加入去离子水200 mL搅拌均匀；55 ℃超声提取80 min，4 ℃、4 000 r·min离心20 min，取上清液并用去离子水定容至200 mL；向上清液中加入(NH)SO(62.6 g)，4 ℃冰箱中静置24 h；低温4 000 r·min离心30 min，弃上清液，用少量去离子水溶解沉淀并转移至透析袋中，密封置于去离子水中，在4 ℃冰箱中静置24 h，期间每隔3 h换一次去离子水。用10%的BaCl检验透析袋外侧去离子水，直至无沉淀出现；利用Scientz-18ND宁波新芝生物真空冷冻干燥机冷冻干燥，-18 ℃储存备用。

盐溶性蛋白提取:向经提取水溶性蛋白后残渣加入0.5 mol·LNaCl溶液150 mL，搅拌均匀；20 ℃超声提取80 min，4 ℃、4 000 r·min离心20 min，收集上清液；用乙酸调节pH=4.5，4 ℃冰箱中静置24 h；4 ℃、4 000 r·min离心30 min，将沉淀用少量0.5 mol·LNaCl溶液溶解，真空冷冻干燥，-18 ℃储存备用。

醇溶性蛋白提取:向提取盐溶性蛋白后残渣加入75%乙醇溶液 250 mL，搅拌均匀。20 ℃条件下超声提取80 min，4 ℃、4 000 r·min离心20 min，收集上清液。向其中加入相同体积的去离子水，4 ℃冰箱中静置24 h，低温4 000 r·min离心30 min，弃去上清液，将所得沉淀用少量75%乙醇溶液溶解，真空冷冻干燥，-18 ℃储存备用。

碱溶性蛋白提取:向提取醇溶性蛋白后残渣加入0.17 mol·LNaOH溶液100 mL，搅拌均匀。20 ℃超声提取80 min，4 ℃、4 000 r·min离心20 min，收集上清液，并用0.17 mol·LNaOH溶液定容至100 mL。用乙酸调节pH=4.7，加入(NH)SO(43 g)，4 ℃冰箱中静置 24 h，低温4 000 r·min离心30 min，弃去上清液，将所得沉淀用少量0.17 mol·LNaOH溶液溶解并转移至透析袋中，密封置于去离子水中，在4 ℃冰箱中静置24 h，期间每隔3 h换一次去离子水。用10%的BaCl检验去离子水，直至无沉淀出现，然后真空冷冻干燥，-18 ℃储存备用。

1.2.4 不同多糖组分提取

根据多糖性质不同，采用累进提取法提取水溶性多糖、酸溶性多糖和碱溶性多糖。

水溶性多糖提取:准确称取脱脂全麦粉10.0 g于烧杯中，加入0.1 g α-淀粉酶和150 mL蒸馏水，搅拌均匀，在60 ℃条件下超声提取40 min；然后4 ℃、4 000 r·min离心20 min，收集上清液；旋转蒸发浓缩，然后加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃冰箱中静置24 h醇沉，用同样参数离心获得沉淀。

蒸馏水稀释脱蛋白处理：将稀释液(所得沉淀：HO=1∶5)与sevage试剂(氯仿∶正丁醇=2∶1)2∶1混合，振荡摇匀，4 ℃、4 000 r·min离心10 min，取上清液，旋转浓缩，真空冷冻干燥，-18 ℃储存备用。

酸溶性多糖提取:向经处理后残渣加入100 mL 0.1 mol·LHCl溶液，搅拌均匀，在20 ℃条件下超声提取40 min；4 ℃、4 000 r·min离心30 min，收集上清液真空浓缩；加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃冰箱中静置24 h醇沉，离心获得沉淀。脱蛋白处理同上。

碱溶性多糖的提取：向经处理后残渣加入100 mL 0.1 mol·LNaOH溶液，搅拌均匀，在60 ℃条件下超声提取40 min；4 ℃、4 000 r·min离心30 min，收集上清液真空浓缩；加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃冰箱中静置24 h醇沉，离心获得沉淀。脱蛋白处理同上。

1.2.5 核糖组分提取

参考徐慧等弱碱盐法，并稍作修改。准确称取脱脂全麦粉10.0 g于烧杯中，加入150 mL 6.5%的NaCl溶液，搅拌均匀，在80 ℃条件下超声提取60 min；4 ℃、4 000 r·min离心 20 min，收集上清液真空浓缩；然后进行脱蛋白处理，用HCl调节其pH=2.5，4 ℃冰箱中静置 12 h，离心弃去上清液，用95%乙醇浇淋沉淀，离心，真空冷冻干燥处理。

1.2.6 抗氧化活性测定

将上述提取的各组分用相应提取溶剂进行溶解，设置不同的浓度梯度进行抗氧化活性研究，以Vc作对照。

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)自由基清除率测定：参考唐艳萍等方法，并稍作修改。试管中加入0.08 mL样品溶液，加入8.0 mL ABTS 工作液，混匀，于暗处反应10 min，利用UN-9000S型上海元析双光束紫外-可见分光光度计在734 nm处测定吸光值。

清除率=(A-A)/A×100%

式中，A:ABTS工作液吸光度；A:加入样品溶液反应后的吸光度

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率测定：参考何荣等方法,并稍作修改。

配制0.1 mmol·LDPPH乙醇溶液；在试管中加入0.2 mL样品溶液，再加入7.8 mL DPPH 乙醇溶液，混匀，于暗处静置30 min，在517 nm处测定吸光值。

清除率=(A-A)/A×100%

式中，A：DPPH乙醇溶液吸光度；A:加入样品溶液反应后的吸光度。

Fe还原能力测定(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)：参考刘旷等方法，并稍作修改。配制FRAP工作液，37 ℃水浴保温备用。将200 μL待测样品加入试管中，然后加入600 μL蒸馏水、6 mL FRAP工作液迅速混匀，将试管置于37 ℃水浴保温10 min，在波长593 nm处测定吸光值。

FRAP Fe还原能力以 △A=A-A表示

式中，A:不加样品的吸光度；A:加入样品溶液反应后测得的吸光度。

1.3 数据分析

用Excel作图，用SPSS 13.0中的Duncan进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 运黑14207硒及各活性组分含量分析

运黑14207全麦粉中硒含量为0.185 mg·kg。

由图1可知，在各提取组分中，水溶性多糖含量最高，为11.08%，其次是碱溶性蛋白、碱溶性多糖，分别为7.07%、2.52%，核糖与水溶性、盐溶性以及醇溶性蛋白的含量较低，分别为 1.77%、1.77%、1.20%、0.81%，含量最低的是酸溶性多糖，仅为0.25%。

WSP:水溶蛋白；SSP:盐溶蛋白；ASP:醇溶蛋白；AlSP:碱溶性蛋白；WSPO:水溶性多糖；ASPO:酸溶性多糖；AlSPO:碱溶性多糖；R:核糖。下同。WSP:Water-soluble protein；SSP:Salt-soluble protein；ASP:Alcohol-soluble protein；AlSP:Alkali-soluble protein；WSPO:Water-soluble polysaccharide；ASPO:Acid-soluble polysaccharide；AlSPO:Alkali-soluble polysaccharide；R:Ribose.The same in figures 2-5.图1 运黑14207不同提取组分得率Fig.1 Extraction rate of different components

2.2 运黑14207不同提取组分的硒含量

由图2可知，运黑14207籽粒不同提取组分的硒含量不同。蛋白质中硒含量最高，显著高于多糖与核糖中的硒含量(<0.05)，以水溶性蛋白的硒含量最高，为1.53 mg·kg。说明被测活性组分中，硒主要以硒蛋白的形式存在。

图2 不同组分硒含量比较Fig.2 Comparison of selenium content in different components

由表1可知，运黑14207各提取组分中有机硒含量占总硒含量58.56%。碱溶性蛋白结合硒占比最多，达23.38%，其次为水溶性蛋白结合硒，占比为14.72%。说明运黑14207粉中的有机硒主要是以蛋白结合态形式存在，且碱溶性蛋白硒占比最高。

表1 各组分硒含量所占总硒比例Table 1 Proportion of selenium content in each component to the total selenium

2.3 被提取活性物质的抗氧化活性分析

2.3.1 ABTS自由基清除率比较

由图3可知，不同提取组分均具有清除ABTS自由基能力,且随着浓度增加清除能力增强，即其抗氧化性越强。四种蛋白组分中(图3A)，当浓度低于4 mg·mL时，水溶性蛋白对ABTS自由基的清除率最强，其次为醇溶性、盐溶性、碱溶性蛋白；当浓度为5 mg·mL时，碱溶性蛋白对ABTS自由基清除率最强。三种多糖组分中，当浓度低于2 mg·mL时，水溶性多糖对ABTS自由基清除率最强，当浓度超过3 mg·mL时，碱溶性多糖的清除率大幅提高，5 mg·mL时最高清除率可达65%(图3B)，相当于0.1 mg·mLVc清除率。核糖对ABTS清除率随浓度变化不明显。

图3 不同组分对ABTS自由基清除能力Fig.3 Free radical scavenging ability of different components to ABTS

2.3.2 DPPH自由基清除能力比较

由图4可知，不同提取组分对DPPH自由基均有清除能力。随着样品浓度的增加对DPPH自由基清除率增高，表明其抗氧化性增强。图4A表明，同一浓度下四种蛋白组分比较，水溶性蛋白的DPPH自由基清除率最强，其次为醇溶性、盐溶性、碱溶性蛋白。三种多糖组分中，水溶性多糖的DPPH自由基清除率最高，当浓度大于 1 mg·mL时清除力超过25%，接近0.15 mg·mLVc清除率，其次是碱溶性多糖和酸溶性多糖，二者清除能力基本相同。核糖提取物对DPPH自由基清除率随浓度提高而增高，但总清除率低于其他提取物。

图4 不同组分对DPPH自由基清除能力Fig.4 Free radical scavenging ability of different components to DPPH

2.3.3 Fe还原能力比较

由图5可知，不同提取组分均具有Fe还原能力，但较对照Vc清除能力均较低。由图5A可知，同一浓度下四种蛋白组分比较，水溶性蛋白对Fe还原率最高，最大为0.27，相当于0.025 mg·mLVc对其清除率，其次为醇溶性、盐溶性、碱溶性蛋白。三种多糖组分比较，水溶性多糖对Fe还原率最高。核糖对Fe还原率随着浓度的增加而增大，但对其总清除能力较其他提取物弱。

图5 不同组分对Fe3+还原能力Fig.5 FRAP of different components to Fe3+

3 讨 论

我国将硒含量超过40 μg·kg的谷物定义为富硒谷物，运黑14207硒含量为185 μg·kg，属于富硒谷物范畴，且有机硒含量占总硒含量58.56%，此结果与程建中等认为植物有机硒占硒总量80%以上不同，主要原因可能与物种、生长环境和提取方法等有关。运黑14207中有机硒主要是以蛋白结合态形式存在，其占总有机硒含量的78.84%。各组分间硒含量比较，水溶性蛋白中硒含量最高，为1.53 mg·kg，与赵萍等的研究结果一致；而碱溶性蛋白的硒含量占总硒含量比例最高，为 23.38%，其次是水溶性蛋白。本研究所提取的八活性种组分中，水溶性多糖得率最高，得率为 11.08%，其次是碱溶性蛋白，得率为7.07%。在抗氧化特性研究方面，相同浓度下，水溶性多糖及水溶性蛋白较其他组分对ABTS、DPPH、Fe均具有较高的清除率，但均低于对照Vc。水溶性多糖浓度5 mg·mL时对ABTS自由基清除率最高，达65%，相当于0.1 mg·mLVc溶液清除率；水溶性多糖浓度大于1 mg·mL时对DPPH自由基清除率超过25%，接近0.15 mg·mLVc溶液清除率；水溶性蛋白浓度为 5 mg·mL时对Fe还原力最强，为0.27，相当于0.025 mg·mLVc溶液清除率。硒多糖是一类由硒和多糖共价结合而形成的功能性多糖。有研究报道，通过亚硒酸酯化修饰获得的硒多糖，不但保留了多糖的基本结构和生物功能，而且使其更容易被吸收利用，提高了硒元素的生物利用度，表现出比硒元素和多糖本身更高的抗氧化、降血糖和免疫调节活性。

植物是有机硒的最好载体，也是人类最安全的硒源。本研究为运黑14207有机硒的分离纯化提供了借鉴，也为富硒成分的富集指明了研究方向。但依然需要对运黑14207中各含硒组分进行进一步工艺优化与纯化，并对各种含硒组分的结构进行深入研究和分析，且加强相关富硒功能食品研发。