龙 举，曾军杰，梅光明

(浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021)

近年来，随着社会经济的飞速发展，我国对石油的进口量也逐年递增[1]，进而大型油船事故也随之增加[2]。2018 年1 月6 日，巴拿马籍油船“桑吉”轮与香港籍散货船“长峰水晶”轮在东海海域发生碰撞，导致“桑吉”轮全船失火，13.6 万t 船载石油进入海洋中[3]。油船事故的发生无疑会对海洋生态环境造成不可估量的巨大损害[4]，石油烃(petroleum hydrocarbon)则已成为我国海域海洋污染因子中最主要的物质之一[5]，尤其是石油烃中芳香烃类物质会对海洋生物的成长造成巨大的危害[6]。石油烃在海洋中能被胶体颗粒物和悬浮颗粒物所吸附[7]，再通过海洋生物的体肤渗透以及呼吸代谢后蓄积在生物体内，一方面导致海洋生物体型变化直至畸形[8]，另一方面海洋生物的生长繁殖也会受影响[9]。海洋生物通过生物富集作用吸收了水体中的石油烃后[10]，通过众多常见海捕鱼直接影响着人类的食品安全[11]。因此，大批量准确快速测定海捕鱼中石油烃含量能及时提供科学可靠的监测数据，对保障人们食品安全方面具有重大意义。现行的检测石油烃的方法相对较为成熟，其主要有紫外分光光度法[12]、红外光度法[13]、重量法[14]、荧光分光光度法[15]、液相色谱法[16]以及气相色谱法[17]等。本实验基于《GB 17378.6-2007 国家海洋监测规范(第六部分:生物体分析)》[18]，对样品前处理操作过程、时间选择、试剂使用量等进行了合理分配，操作上去繁就简、合理规范，大大缩短了样品处理的时间。利用三维相关光谱技术分析了荧光条件Ex/Em=230/280 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 时石油烃荧光强度及加标回收率。通过本研究，得到结果准确、能满足海捕鱼中石油烃大批量检测的方法，并归纳总结了海捕鱼中石油烃测定实验须注意的一些问题。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器设备

1.1.1 实验材料

实验样品均为海捕鱼类，清水洗净后取海捕鱼可食肌肉部分用组织捣碎机捣碎，混合均匀，-18 ℃冷冻保存。

试验用水为Milli-Q 超纯水；氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇，优级纯；石油醚(沸点范围60～90 ℃)，分析纯；二氯甲烷，色谱纯；

6 mol·L-1氢氧化钠溶液:准确称取240 g 氢氧化钠，加水溶解并定容到1 000 mL(按需要可同比例增加或减少)冷却至室温备用；

饱和氯化钠溶液:用40 ℃温水配制饱和氯化钠溶液，待冷却至室温后形成过饱和氯化钠溶液备用；

脱芳石油醚:石油醚经60 目活性炭层析柱约每分钟60～100 滴流速过柱处理后收集备用；石油类标准溶液:浓度:1 000 mg·L-1(±3%)，购于国家海洋环境监测中心；原始编号:GBW(E) 080913；有效期:室温保存3 个月。

石油类标准使用液:取石油类标准溶液5.0 mL 于50.0 mL 棕色容量瓶中用石油醚稀释并定容至刻度得100.0 mg·L-1石油类标准使用液，3 个月内使用。

1.1.2 仪器设备

RF-600 型荧光光谱仪(岛津通用仪器有限责任公司)；可调温水浴旋转蒸发仪(瑞士Buch 公司)；分液漏斗振荡器、THZ-92A 气浴恒温振荡器(上海博远实业医疗设备厂)；活性炭层析柱(滁州长城玻璃仪器制造厂)；台式天平(SL-502 型，上海华岩设备仪器有限公司)；电子天平(AL204 型，瑞士梅特勒-托利多仪器公司)；组织捣碎机(T18 基本型，托利多仪器有限公司)；具塞皂化瓶，聚四氟乙烯分液漏斗。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

称取(2.0±0.2) g 完全解冻的样品于100 mL 皂化瓶中，加入6 mol·L-1氢氧化钠溶液20 mL，手动振荡混合均匀，转移至恒温振荡器中需避光40 ℃、1 500 r·min-1振荡皂化6 h，皂化完全后瓶中无块状样品。加入20 mL 无水乙醇摇晃使反应混合更加充分，静置2 h 后转移至聚四氟乙烯分液漏斗中。分别用二氯甲烷10 mL 冲洗皂化瓶2 次均倒入分液漏斗中，加入100 mL 水和30 mL 饱和氯化钠溶液防止乳化，手动摇晃适当放出气体后再放置到分液漏斗振荡器2 500 r·min-1振荡2 min，充分萃取后静置至明显分层，收集下层二氯甲烷于鸡心瓶中，40 ℃水浴旋转蒸发仪(转速10～15 r·min-1为宜)浓缩至干，冷却到室温后加入10 mL脱芳石油醚，摇晃鸡心瓶使内壁充分荡洗后静置待测，同时做空白对照实验。

1.2.2 测定波长

设置RF-600 型荧光光谱仪的狭缝宽度均为5 nm，光谱仪的扫描速度为10 000 nm·min-1，激发和发射波长的采样间隔分别为5 nm 和2 nm；激发和发射波长均设置为200～450 nm。浓度为5.0 mg·L-1的石油烃标准液三维相关光谱如图1 所示。由图1 可知，石油烃的三维相关光谱主要存在2 个明显的荧光特征峰，中心峰位于Ex/Em=230/340 nm 附近的荧光峰和位于Ex/Em=270/314 nm 附近的荧光峰，石油烃在Ex/Em=270/314 nm位置具有最大荧光强度。现行标准《GB 17378.6-2007 国家海洋监测规范(第六部分:生物体分析)》中使用Ex/Em=310/360 nm位置荧光强度则较弱。

图1 5.0 mg·L-1 石油标准溶液三维相关光谱图Fig.1 Three-dimensional correlation of petroleum hydrocarbon at 5.0 mg·L-1

1.2.3 标准曲线绘制

根据1.2.2 所得石油烃特征峰光谱条件和现行标准中光谱条件，分别取油标准使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以样品相同的条件进行皂化反应及萃取、浓缩、复溶等操作，采用Ex/Em=310/360 nm条件下测定各标准点的荧光强度进行计算，以荧光强度值为纵坐标Y，石油烃的质量浓度为横坐标X，绘制标准曲线。

1.2.4 样品测定

海捕鱼样品经皂化、萃取、浓缩、复溶静置沉淀后，转移适量上清液至1 cm 光程的适应比色皿中进行测定，根据其在Ex/Em=310/360 nm 条件下的荧光强度进行定量，通过标准曲线方程计算出海捕鱼样品中石油烃含量。

2 结果与讨论

2.1 皂化条件的选择

2.1.1 样品状态

由于现有标准皂化条件过于耗时耗力，本实验在现行标准基础上加以改进。实验中影响皂化结果的条件主要有样品状态、样品种类、皂化温度、摇动力度及频率、皂化时间等。海捕鱼样品-18 ℃冷冻保存后为坚硬块状，若解冻不充分，则大大延长了皂化时间，且影响皂化进度及效果，故样品需充分解冻为肉糜状后方可进行皂化，在批量检测海捕鱼样品中石油烃时可提前对相应的样品进行解冻。以鳗鱼样品和黄姑鱼样品为例，未充分解冻海捕鱼样品对皂化结果的影响见表1。

表1 海捕鱼样品状态对皂化结果的影响Tab.1 Effect of sea fishes sample status on saponification results

2.1.2 皂化条件

样品的皂化过程是由过量的氢氧化钠作为反应物质的复杂反应[19]。皂化条件主要包括温度、振荡转速及时间，在一定范围内，提高温度、加大振荡转速均有利于缩短皂化过程的时间。批量检测海捕鱼样品中石油烃含量的实验中，实验室常用使样品皂化过程保持一定温度的方式有恒温水浴和恒温气浴2 种[20]。实验发现:恒温水浴和恒温气浴2 种方式对皂化时间及皂化效果无明显差异，而恒温气浴则更加方便操作，故本实验选择恒温气浴方式进行。样品皂化过程温度选择实验使用恒温气浴振荡器，振荡转速1 000 r·min-1下分别选择气浴温度30、35、40、45 ℃进行对比试验。结果发现，气温越高皂化速度越快，在温度40 ℃时选择的4 种海捕鱼样品均能在不超过6 h 就完全皂化；温度45 ℃时虽然皂化耗时更短，但不明显，且皂化瓶玻璃塞常有冲出，导致皂化液体溅出，故本实验选择气浴温度为40 ℃。多种海捕鱼样品皂化反应耗时见表2。

表2 海捕鱼样品皂化反应耗时表Tab.2 Time of sea fishes sample saponification reaction

2.2 荧光条件

文献中关于荧光条件选择以《GB 17378.6-2007 国家海洋监测规范(第六部分:生物体分析)》为准，即Ex/Em=310/360 nm 时测定样品中石油烃荧光强度，再由标准曲线计算出样品石油烃含量。经实验对石油烃标准品在激发波长200～450 nm 范围、发射波长在200～450 nm 范围进行三维荧光扫描后发现:石油烃标准品在Ex/Em=230/340 nm 时具有最高荧光强度响应值，在Ex/Em=270/314 nm 时具有较高荧光强度响应值，而在Ex/Em=310/360 nm 时荧光强度响应值很低。在3 组荧光条件下分别做加标回收实验对比，结果显示在Ex/Em=310/360 nm 时回收率能满足样品检测质控要求，而另外2 组荧光条件回收率都偏高。故荧光条件选择Ex/Em=310/360 nm。

图2 试剂空白三维相关光谱图Fig.2 Three-dimensional correlation of reagent blank

图3 鳗鱼样品三维相关光谱图Fig.3 Three-dimensional correlation of eel samples

2.3 标准曲线及线性方程

根据1.2.2 所得石油烃特征峰光谱条件和现行标准中光谱条件，分别取石油标准使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以样品相同的条件进行皂化反应及萃取、浓缩、复溶等操作，采用Ex/Em=230/340 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 条件下测定各标准点的荧光强度进行计算，以荧光强度值为纵坐标Y，石油烃的质量浓度为横坐标X，绘制标准曲线，3 组荧光条件下标准曲线图见图4。线性相关系数均大于0.99，可满足石油烃定量要求。

图4 石油烃测定标准曲线图Fig.4 Standard curve of petroleum hydrocarbon

2.4 方法回收率和精密度

以带鱼和鲳鱼样品作为实验基质在荧光条件Ex/Em=310/360 nm 下做2 组加标回收实验，同时做空白对照实验，扣除背景值计算回收率。每组4 个石油类标准品加标水平分别是2.0、5.0、10、20 mg·kg-1，准确称取带鱼样品和鲳鱼样品各2.0 g，每个水平做6 个平行，测定石油烃含量，计算回收率和相对标准偏差。计算结果如表3 所示，方法回收率为80%～102%，相对标准偏差均小于8.0%，数据表明实验方法有较高的回收率和精密度。

表3 样品中添加回收率及方法的精密度试验(n=6)Tab.3 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=6)

2.5 样品测定结果

使用该方法对来自舟山市普陀区、嵊泗县、岱山县、定海区捕捞渔船和渔获运输船共99 批次海捕鱼进行测定，其中鲳鱼样品15 批次，占比15%；带鱼样品26 批次，占比26%；鳗鱼样品22 批次，占比22%；小黄鱼样品11 批次，占比11%；鲅鱼样品9批次，占比9%；其他鱼类样品16 批次，占比16%。海捕鱼样品种类分布比例如图5。

图5 海捕鱼种类分布比例图Fig.5 The proportion of sea fishes species

分析测定结果显示各相关海捕鱼样品中石油烃的含量，测定结果见表4。由表可知:石油烃检出率为90.9%，检出值在1.1～20 mg·kg-1，且部分样品检出值较高。其他海捕鱼样品中，1 份舌鳎样品和1 份白姑鱼未检出，鲐鱼含量最高为9.4 mg·kg-1。舟山港口及船舶工业发达，同时受2018 年年初“桑吉”轮沉船事故影响，给舟山海域水产品带来较大的石油烃污染风险。

表4 部分海捕鱼中石油烃的含量Tab.4 The amount of petroleum hydrocarbon in different sea fishes

3 结论

实验对荧光分光光度法测定海捕鱼肌肉组织中石油烃含量进行了研究，主要对操作过程中皂化条件以及仪器测定时荧光光谱条件的选择做了改进。现行的《GB 17378.6-2007 国家海洋监测规范(第六部分:生物体分析)》作为海洋环境监测标准，其关于生物体中石油烃的测定更加侧重于海洋环境的监测，通过监测海洋生物体石油烃的含量来评判海洋环境现状。寻求更加适合水产品质量安全管理方面的测定海捕鱼中石油烃的方法，为以后建立测定水产品中石油烃的标准做出一点探索。利用三维相关光谱技术分析了海捕鱼中石油烃检测的荧光条件，Ex/Em=230/340 nm 及Ex/Em=270/314 nm 时荧光强度高，回收率偏高；Ex/Em=310/360 nm 时荧光强度偏低，但回收率能满足实验室质控要求。Ex/Em=310/360 nm 时荧光强度偏低，但回收率能满足实验室质控要求。

在测定海捕鱼中石油烃含量的实验中，注意皂化反应必须进行彻底，不能使用凡士林涂抹分液漏斗，旋蒸时需控制转速以保证不产生暴沸，不能使用封口膜对旋蒸瓶进行封口，复溶样品须静置沉淀后取上清液进行测定。此方法中试剂干扰小，测定结果能反映真实情况，具有较好的重现性和较高的精密度，更加适用于海捕鱼样品中石油烃的批量检测。