李 莹，何顺武，曹 平

(1.重庆理工大学 化学化工学院，重庆 400054;2.贵州大学 化学与化工学院，贵阳 550025)

0 引言

鸢尾(Iris)，又名紫蝴蝶、蓝蝴蝶、乌鸢，是一种生态分布极为广泛、种类繁多、富含酶系统的绿色植物［1］。《神农本草经》［2］指出鸢尾叶中含有抗炎消肿、镇痛收敛、止血散淤、消化不良等功效的碳酸酚和抗病毒作用的黄酮，有较高的药用价值［3-9］。正常条件下，植物细胞内关键酶活性的产生和释放处于动态平衡模式，关键酶可将有毒物质氧化成无毒物质，对植物体起保护作用，但随着现代工农业的快速发展，氯氟烃类和氯化氮等化学物质的大量排放严重损坏了臭氧层结构，平流层臭氧的减薄促使UV-B(280～320 nm)辐射增强，导致自由基不断积累，逐渐降低了绿色植物关键酶的活性，对植物的正常生长、代谢和基因转变等造成严重影响，已成为了备受关注的热点问题［10-19］。

UV-B 辐射是影响植物生长的一项指标，它可能改变植物的高度和叶面积，同种植物在UV-B 辐射增强下，植株在形态方面呈现不同的变化，从而改变种间的相互关系，生态系统的结构和功能也会改变。近年的一些研究表明，UV-B 辐射会影响抗坏血酸过氧化物酶(APX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性。当植物受到胁迫时，植物细胞中控制物质代谢的关键酶首先做出反应。APX、PAL、GR 是植物代谢过程的3种关键酶，与植物的抗性密切相关［20-28］。本实验通过对鸢尾叶片进行UV-B 辐射处理，利用紫外可见分光光度法测定3 种不同UV-B 辐射强度条件下，APX、PAL、GR 酶的活性变化情况，探究酶活性在辐射强度和辐射时间下的影响。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

鸢尾叶片，采自贵州大学民族学院;KH2PO4、Na2HPO4，AR，金维城钼业股份有限公司化学分公司产品;硼酸，AR，上海国药化学试剂公司产品;聚乙烯吡咯烷酮，AR，上海国药化学试剂公司产品;酚酞指示剂，AR，天津市科密欧化学试剂公司产品;H2O2，AR，上海昆化精细化工有限公司产品;HCl，AR，武汉华翔科洁生物技术有限公司产品;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，AR，上海国药化学试剂公司产品;研钵，ZH9167，北京中慧天诚科技有限公司;石英比色皿，石英微量，江苏省宜兴市精瑞光学元件厂;低温离心机，TGL-16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司;紫外分光光度计，UV2000，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;恒温加热磁力搅拌器，78HW-1，杭州仪表电机有限公司;恒温水浴锅，TCKW-D-1，北京同德创业科技有限公司。

1.2 试剂的配制

缓冲溶液:取10 mL Na2HPO4溶液与90 mL KH2PO4溶液，加入10-4mol/L EDTA-2Na 和去离子水，于25 ℃水浴搅拌下混合均匀，保持酸性pH=7～8，用去离子水补至100 mL，配制0.05 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH=7～8);取1.24 g 硼酸，1.91 g 硼砂，加去离子水混合溶解，配制0.1 mol/L 硼酸盐缓冲液配制(pH=8.8)。置于4 ℃储存。

反应溶液:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，抗坏血酸(ASA，现配现用)，H2O2;苯丙氨酸，HCl;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，还原型谷胱甘肽(GSSG)。

1.3 酶液的提取

取新鲜的鸢尾叶片洗净，切成2 cm×2 cm 的块片，用去离子水洗涤后用滤纸拭干，将块片平铺在湿润滤纸的培养皿中，置于同一时间(单位:d)、168、210、252 μw/cm23 种不同的UV-B 辐射及同一辐射强度(单位:μw/cm2)、3 个不同时间段(根据不同酶处理要求，选择第3、7、14、21 d 中任3 个时间取样)下处理24 h，以诱导关键酶。将诱导处理的块片加入液氮研成粉末，按样本粉末质量(g):缓冲液体积(mL)=1∶5～10 加入PVP 溶液中，于恒温水浴搅拌反应装置下进行匀浆(注:温度不超过25 ℃)，将所得匀浆抽气过滤，滤液10 000 r/min，4 ℃下离心20 min，上清液为酶粗提取液。

1.4 活性的测定

1.4.1 APX 活性测定

取4 支10 mL 试管(3 支测定管A1、A2、A3，1 支对照管A0)，分别加入0.1 mL 酶液(168 μw/cm2)，1.7 mL 磷酸盐缓冲液(pH=7)，0.1 mL 0.06 mol/L H2O2，0.1 mL 0.03×10-3mol/L ASA(对照管不加，用去离子水代替)。摇匀后置于20 ℃恒温水浴锅保温30 min，利用紫外可见分光光度计在波长290 nm 下测定并记录10、130 s 的吸光值A0、A1、A2、A3，其中ΔA空=A0-A1，ΔA测=A2-A3。同理，按照相同方法测定同一辐射时间、不同辐射强度与同一辐射强度、不同辐射时间的吸光度值，根据APX样本质量计算出APX 的活性，即:

式(1)中:HAPX为APX 的活性(U/g);V总为反应体系总体积(mL);V液为酶液体积(mL);n稀为样品测试前稀释倍数;ω 为消光摩尔系数;r比色为比色半径(cm);V取样为取样量(mL);m 为样本鲜重(g);t 为反应时间(min)。

1.4.2 PAL 活性测定

取4 支10 mL 试管(3 支测定管，1 支对照管)，分别加入1.0 mL 酶液(168 μw/cm2)，2.0 mL 硼酸盐缓冲液(pH=8.8)，1.0 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸(对照管不加，用去离子水代替)，总体积4.0 mL。摇匀后置于30 ℃恒温水浴锅中保温1 h，加入0.2 mL 6mol/L HCl 终止反应，将沉淀离心，用对照管调零，在290 nm 处检测测定管与对照管反应液的吸光度，分别记为A测、A对，即ΔA=A测-A对，同理按照相同方法测定同一辐射时间、不同辐射强度与同一辐射强度、不同辐射时间的吸光度值，根据PAL 样本鲜重计算PAL 的活性:

式(2)中:HPAL为PAL 的活性(U/g);ΔA=A测-A对;V总为反应体系总体积(mL);V液为酶液体积(mL);V取样为取样量(mL);m 为样本鲜重(g);t为反应时间(min)。

1.4.3 GR 活性测定

取4 支10 mL 试管(3 支测定管，1 支对照管)，分别加入0.2 mL 酶液(168 μw/cm2)，3 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.5，含10-3mol/LEDTA)，0.03 mL 3×10-3mol/L 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，0.1 mL 5×10-3mol/L 还原型谷胱甘肽(GSSG)(对照管不加，用去离子水代替，摇匀迅速倒入石英比色皿中，用对照管调零，紫外分光光度计在340 nm 处比色，30 s 时读取吸光度值A1;将此比色皿中的比色液倒入原试管中，置37 ℃水浴2 min 后迅速倒入石英比色皿中，210 s时读取吸光度值A2;求出2 次吸光度值差值ΔA=A1-A2。利用直接测定法测定蛋白质浓度:①在紫外分光光度计上将未知蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280、260 nm 波长的吸光度(A280及A260);②为方便起见，对于混合蛋白质溶液，可用A280乘以0.75 代替其中蛋白质的大致含量(104mg/L)。按照相同方法测定同一辐射时间、不同辐射强度与同一辐射强度、不同辐射时间的吸光度值，根据样本蛋白浓度计算出GR 的活性。

式(3)中:HGR为GR 的活性(U/g);ΔA=A1-A2;n稀为样品测试前稀释倍数;r比色为比色半径(cm);m 为样本鲜重(g);t 为反应时间(min);C为蛋白质质量浓度(g/L)，C=1.45A280-0.74A260。

2 结果与分析

2.1 APX 结果分析

根据APX 酶活性计算公式对测定结果处理后，将计算结果通过Excel 绘制以酶含量(单位:μw/min)为纵坐标，辐射强度(单位:μw/cm2)为横坐标的APX 含量变化图1(a)与辐射时间(单位:d)为横坐标的APX 含量变化图1(b)。

图1 APX 含量变化曲线

由图1(a)可知，当辐射时间相同时，APX 活性随着辐射强度而增加，对照叶片的APX 活性在第7 d 取样上升，第14 d 取样APX 含量随辐射强度的增强逐渐下降，第21 d 取样中APX 含量呈现先降低再升高，与对照相比(酶含量持平约为1.18 μw/min)，C 时含量为零，说明低辐射对APX 酶活性产生了胁迫作用。随UV-B 辐射增加，APX 含量在H 时超过对照，第14、21 d 时，增加UV-B 辐射处理的酶活性均低于对照，活性约0.09 μw/min。图1(b)中，当辐射强度相同时，随着辐射时间的增长，APX 活性先略微降低后持平，与对照相比(APX 含量为0.8～1 μw/min)延长辐射时间处理逐渐降低，辐射强度为C 和L 时，APX 含量先升高再下降趋势，第7 d 取样C 处理时，APX 含量为零，可能原因是辐射强度与辐射时间对酶活性产生了胁迫作用。辐射强度到达H 时，APX 含量先下降，然后保持平稳，APX 含量基本保持在0.1 μw/min。

2.2 PAL 结果分析

根据PAL 酶活性计算公式对测定结果处理后，将计算结果通过Excel 绘制以酶含量(单位:μw/min)为纵坐标，辐射强度(单位:μw/cm2)为横坐标的PAL 含量变化图2(a)与辐射时间(单位:d)为横坐标的PAL 含量变化图2(b)。

图2 PAL 含量变化曲线

由图2(a)可知:同一辐射时间，PAL 含量随着辐射强度呈现上升或先升高后降低的趋势，前期积累PAL，中后期含量下降，后期趋于平衡。第7 d PAL 含量呈现先升高再降低的趋势，而第3、21 d取样PAL 含量一直上升，与对照相比(PAL 含量为0.04～0.05 μw/min)，UV-B 辐射处理有明显差异(P＜0.05)，证明UV-B 辐射对酶活性有显著影响;而图2(b)中，当辐射强度相同时，随着辐射时间的延长，UV-B 辐射强度为C 时，酶含量先下降再升高，而UV-B 辐射强度为L 和H 时，酶含量均升高，在7 d 取样时，PAL 酶含量较高且辐射强度为H 时的酶含量高于UV-B 辐射强度C 和L 时的酶含量，第21 d 时，辐射强度为L 时的PAL 含量大于辐射强度为C 和H 的PAL 含量，与对照相比(PAL 含量约为0.007 μw/min)略微上升，最高可达0.12 μw/min。

2.3 GR 结果分析

根据GR 酶活性计算公式对测定结果处理后，将计算结果通过Excel 绘制以酶含量(单位:μw/min)为纵坐标，辐射强度(单位:μw/cm2)为横坐标的GR 含量变化图3(a)与辐射时间(单位:d)为横坐标的GR 含量变化图3(b)。

图3 GR 含量变化曲线

由图3(a)可知，辐射时间一定，GR 含量随着UV-B 辐射强度增强有较大的变化，第3、21 d 取样中，GR 含量呈现大幅度降低的趋势，辐射强度为L 时，第3 d 取样中，GR 含量出现负值，可能是短时间的辐射时间对GR 酶活性产生了胁迫作用，第7 d 取样中，GR 含量逐渐下降，与对照相比(GR 含量为0.02～0.04 μw/min)，3 个不同时间段取样时，低辐射强度对GR 活性较为有利;图3(b)中，当辐射强度相同，辐射时间逐渐延长时，3 种辐射强度下的GR 含量随着取样时间变化的幅度较大，低辐射时，3 个时间段的GR 含量较高，但趋于急速下降形势，UV-B 辐射强度为C 时，第7 d 取样中GR 的含量相对较好，UV-B 辐射强度为L 时，GR 活性表现为第7 d 取样＞对照组＞第21 d 取样＞第3 d 取样，辐射强度L 处，第3 d 取样分析时，GR 含量为零，可能是ASA 被还原，存在高辐射短时间等，造成GR 酶活性受到了胁迫，导致酶失活。第21 d 取样时，3 种不同UV-B 辐射强度处理下，GR 含量在0.01～0.3 μw/min 范围，与对照组(GR 含量约为0.02 μw/min)有显著差异(P＜0.01)，第3、21 d 取样中，GR 活性均大于第7 d，高辐射强度对GR 活性有胁迫作用。

3 结论

1)鸢尾叶中酶的活性与其逆境条件(辐射强度)和胁迫时间(辐射时间)有关。从酶活性的变化过程可以看出，低UV-B 辐射强度时，APX、PAX酶活性受到抑制，随着时间的延长，植物形成相应的防御机制，酶活性出现升高趋势，而低UV-B 辐射强度时，GR 酶活性较好，这与自身携带的苯丙氨酸衍生物关系密切。

2)在辐射时间不变、辐射强度变化时，不同辐射强度梯度下，在辐射强度为C(168 μw/cm2)时，鸢尾叶GR 酶的活性最好，而APX、PAL 酶在辐射强度为H(252 μw/cm2)时活性相对较好。由此发现鸢尾植物中不同的酶抗辐射能力不同，其中APX、PAL 酶的抗辐射能力处在较高水平，能够接受较强的辐射;而GR 酶的抗辐射能力最弱，不能够承受高强度的辐射胁迫。

3)在辐射强度不变、辐射时间变化时，不同辐射时间梯度下，APX 酶在第14 d 取样时，酶含量最高，活性最好，而GR、PAL 酶在第7 d 取样时，酶含量相对较高，活性相对较好。由此发现鸢尾叶中关键酶活性和辐射时间的关系为在中等辐射时间段酶的活性较好，生长发育过程中等阶段的辐射有利于生长，而短时间或长时间的辐射下，酶的含量较低，不适于鸢尾的生长发育。

4)对试验测定结果整理分析发现，APX 含量在辐射强度为C(168 μw/cm2)与辐射为L(210 μw/cm2)时为零;GR 含量在辐射时间第3 d 时为零，说明过低的辐射强度对APX 酶活性产生了胁迫作用，导致酶失活;同理，短时间的辐射时间对GR 酶活性产生了胁迫作用，导致植物中的酶在相应阶段失活。

5)鸢尾植物中不同酶对辐射强度的响应机制不同，在不同的处理时间段，活性会产生不同的变化，与其体内保护酶系统的活力及抗氧化物质含量等有关。