普 娟，马云淑，张贵华，梅佳华，高家菊，叶建州△

（1. 云南中医药大学中药学院·云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室·云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500； 2. 云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021）

脂溢性脱发由雄激素及其受体异常引起，中医称为“发蛀脱发”“蛀发癣”，为皮肤科临床常见病与多发病［1-3］。除脂祛湿生发方为云南某医院治疗脂溢性脱发的临床经验方，原为汤剂，为扩大临床使用范围和提高患者用药依从性，拟开发为丸剂。由菟丝子、枸杞子、地黄、当归、茯苓等9 味中药组方，具有清肺胃之阴、养阴补肾功效。前期研究中已完成除脂祛湿生发丸的制备工艺优化，本研究中建立了制剂的质量标准，以期为后续自动化生产提供质量保障。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity 型高效液相色谱仪（美国Aglient 科技有限公司）；SB-4200 DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）；101-2AB 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四青生化材料厂）；R2000-30型电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司，精度为十万分之一）；SY-30 型四用片剂测定仪（郑州南北仪器设备有限公司）。

1.2 试药

除脂祛湿生发丸（实验室自制，批号分别为20191101，20191102，20191103，规格为每丸0.06 g）；金丝桃苷对照品（批号为111521 - 201809）、阿魏酸对照品（批号为110773 - 201915）纯度均大于98%，生地黄对照药材（批号为121180-201506），茯苓对照药材（批号为121117 - 201509），枸杞子对照药材（批号为121072-201611），当归对照药材（批号为120927-201517），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 外观性状

本品外观呈棕褐色，气微，味微苦。

2.2 薄层色谱（TLC）鉴别

菟丝子：分别取3 批样品各适量，研细，取粉末2 g，加甲醇40 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，蒸干，残渣加甲醇1 mL，作为供试品溶液。取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。按处方和制备工艺制备不含菟丝子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮- 甲酸- 水（20∶2∶1.5∶2，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝溶液，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同黄色荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 A。

枸杞子：分别取3 批样品各适量，研细，取粉末1 g，加水35 mL，加热煮沸15 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液。按处方和制备工艺制备不含枸杞子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷（3∶2，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同黄色荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 B。

生地黄：分别取3 批样品各适量，研细，取粉末4 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL，作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液。按处方和制备工艺制备不含生地黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液［3］。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二甲苯- 乙酸乙酯（2∶3，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 C。

当归：分别取3 批样品各适量，研细，取粉末1 g，加甲醇20 mL，超声（功率为200 W，频率为40 kHz）15 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。同法制备当归对照药材溶液。按处方和制备工艺制备不含当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同黄色荧光斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 D。

茯苓：分别取3批样品各适量，研细，取粉末1 g，加乙醚50 mL，超声（功率为200 W，频率为40 kHz）10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液。按处方和制备工艺制备不含当归的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各15 μL，以甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 E。

2.3 一般检查

按2020年版《中国药典（四部）》通则0108 丸剂项下规定对3 批（批号分别为20191101，20191102，20191103）样品进行检验，结果均符合规定。详见表1。

表1 3批样品检查结果Tab.1 Determination results of the three batches of samples

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V，金丝桃苷）和甲醇- 1%醋酸溶液（25∶75，V/V，阿魏酸）；流速：1.0 mL/ min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm（金丝桃苷）和316 nm（阿魏酸）；进样量：5 μL。理论板数按金丝桃苷和阿魏酸峰计均不低于5000。

2.4.2 溶液制备

对照品溶液：分别取金丝桃苷对照品10 mg、阿魏酸对照品12 mg，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1 mg/ mL 的金丝桃苷对照品母液、1.2 mg/ mL 的阿魏酸对照品母液；分别精密量取上述溶液560 μL 和334 μL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇制成质量浓度为22.40 μg/mL 的金丝桃苷对照品溶液、16.032 μg/mL的阿魏酸对照品溶液。

供试品溶液：取3 批样品各适量，研细，取粉末5 g，精密称定，加甲醇溶解，超声30 min，摇匀，用甲醇定容至50 mL 容量瓶中，作为金丝桃苷供试品溶液。取粉末2 g，精密称定，加70%甲醇25 mL，稳定质量，超声（功率为200 W，频率为40 kHz）30 min，补足减失的质量，作为阿魏酸供试品溶液。

阴性对照品溶液：按处方工艺取缺菟丝子和当归的其他药材，按供试品溶液制备方法制备缺菟丝子和当归的阴性对照品溶液。

2.4.3 方法学考察

专属性试验：取2.4.2项下6种溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱与对照品溶液色谱主峰相同，且阴性对照品溶液色谱相同位置处无吸收，对测定无干扰。色谱图见图2。

线性关系考察：分别精密吸取2.4.2项下金丝桃苷对照品溶液1，2，4，6，8，10，12 μL，阿魏酸对照品溶液1，2，5，10，15，20，25 μL，按2.4.1项下色谱条件依次进样测定，记录峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y金=34.053X金+ 1.2166（r= 0.9991，n= 7）、Y阿=76.369X阿- 0.8743（r= 1.0000，n= 7）。结果表明，金丝桃苷、阿魏酸进样量分别在0.021～0.270 μg 和0.016～0.400 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.4.2 项下金丝桃苷、阿魏酸对照品溶液各适量，按2.4.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果金丝桃苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.54%和0.15%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20191101）适量，按2.4.2 项下方法配制供试品溶液，共6 份，按2.4.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果金丝桃苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为1.07%和0.08%（n= 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20191101）适量，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，16，20，24 h 时按2.4.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果金丝桃苷、阿魏酸峰面积的RSD分别为0.92%和0.07%（n= 7），表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20191101），共6 份，精密称定，分别加入金丝桃苷对照品0.55 mg、阿魏酸对照品0.18 mg，按2.4.2 项下方法制备供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 样品含量测定

取3 批样品，按2.4.2 项下方法制备供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件进样测定3 次，记录峰面积，并计算含量。结果见表3。

表3 3批样品中金丝桃苷和阿魏酸含量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of hyperoside and ferulic acid in the three batches of samples（n=3）

3 讨论

3.1 TLC 条件筛选

菟丝子：2020年版《中国药典（一部）》中菟丝子鉴别以聚酰胺薄膜为固定相，但聚酰胺薄膜载体是塑料，易皱曲，难以平稳放入展开缸内，导致色谱效果差。故选择硅胶G 薄层板，以乙酸乙酯- 丙酮- 甲酸- 水（20∶2∶1.5∶2，V/V/V/V）为展开剂，喷以10%三氯化铝溶液显色，斑点清晰，专属性较好。

枸杞子：2020年版《中国药典（一部）》中枸杞子的色谱条件为乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1，V/V/V），实际上斑点比移值过高，降低甲酸比例后也未能改善。故选择乙酸乙酯-三氯甲烷（3∶2，V/V）为展开剂，斑点清晰，专属性良好，比移值适中。

生地黄：分别采用加热回流、甲醇超声后乙酸乙酯萃取和水提取后乙酸乙酯萃取3种方法提取生地黄，结果水提取后再用乙酸乙酯萃取所得色谱图斑点清晰、分离效果良好，且阴性对照无干扰。2020年版《中国药典（一部）》中生地黄鉴别以梓醇为指标性成分，但采用不同提取方法和展开系统均未能检出梓醇。查阅文献［4-8］，发现在加工炮制过程中，生地黄中梓醇的含量会大幅度下降，甚至无法测定，较难鉴别。故选择生地黄药材作为对照。

当归：曾考察碳酸氢钠超声后稀盐酸调节pH，再用乙醚萃取，以及单用甲醇超声处理，结果所得色谱图峰形相近［9］。故选择甲醇超声处理15 min制备供试品溶液。

茯苓：曾考察甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸、石油醚（60～90 ℃）- 甲酸乙酯- 甲酸2 种展开系统，结果前者展开效果更佳，斑点较清晰；曾考察不同显色方法［在紫外光灯（365 nm）下检视、用10%硫酸乙醇］，结果在365 nm波长下检视阴性对照有干扰。故选择甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液显色，特征斑点较清晰，且阴性对照无干扰。

3.2 含量测定流动相、提取方法选择

金丝桃苷：2020年版《中国药典（一部）》中菟丝子的指标性成分金丝桃苷色谱条件为乙腈- 0.1%磷酸溶液（17∶83，V/V），所得色谱图基线平稳，但峰形不理想，各组分分离效果不佳。反复筛选条件，考察不同配比流动相（20∶80，21∶79，V/V），最终确定流动相为乙腈- 0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V），色谱图峰形较好，且各组分分离效果较佳，保留时间适宜，方法专属性强。

阿魏酸：2020年版《中国药典（一部）》中当归指标性成分阿魏酸色谱条件为乙腈- 0.085%磷酸溶液（17∶83，V/V），所得色谱峰拖尾严重，分离度不好。曾考察甲醇-水、甲醇-1%醋酸溶液（40∶60，V/V）等流动相体系，结果甲醇-1%醋酸溶液（25∶75，V/V）作为流动相时峰形较好，分离效果较佳，保留时间适宜［10-11］。同时，以超声、回流、超声后萃取等方法提取阿魏酸，发现以超声处理30 min时各色谱峰分离更佳，峰形较好。