傅伊倩， 张宝海， 何伟明， 韩向阳， 刘庞源

(北京市农林科学院蔬菜研究所，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，蔬菜种质改良北京市重点实验室， 北京 100097)

种质资源是携带物种遗传信息的载体，作为农业科技原始创新、现代种业发展的物质基础，种质资源的收集和保存受到世界各国及相关国际组织的高度重视。根据FAO在2011年统计[1]，截至2010年，全球已建成1 750座基因库，收集保存的种质资源约740万份，而其中的绝大多数(90%)种质资源是以植物种子的形式被异地保存。将种子贮存于基因库中可利用低温、干燥等贮存条件抑制种子新陈代谢，延长种子寿命。然而种子成熟后，在保存过程中就开始了不可避免的衰老进程。在保存的过程中，种子生活力的下降趋势呈现“倒S型”曲线[2]，即在种子保存初期的一段时间内，种子处于较高活力的平台期，而后进入持续快速下降的骤降期，直至种子活力的丧失。可以通过适时监测种子的活力，确定种质繁殖更新的最佳时间点，来确保种质资源的安全，防止种质资源的丢失[3]。

世界各国及相关组织对于种子活力下降至何种水平时需要更新的标准不尽相同。种子从入库保存到发芽率下降，再到需要繁种更新的发芽率临界值的贮藏时间为种质的安全保存期。按照FAO种质资源基因库管理标准[1]，当正常种子生活力下降至入库初始生活力的85%时，应对种子进行繁殖更新。而美国农业部国家种子贮藏实验室曾设定的最低要求为所有库存种子活力需维持在60%以上[4]，俄罗斯对繁种更新的临界值曾要求为种子活力下降为初始发芽率的50%[5]。当一批种子的活力下降至50%(P50)时[6]，种子可能出现的遗传漂变几率变大，遗传完整性也大大降低。从入库初期到下降至P50的时间段定义为种子的保存寿命，这2个时间点在种质资源管理中应重点关注。

种质资源的安全管理需对不同种类的种子生活力进行定期监测，明确种子生活力下降的关键节点。不同蔬菜种子及不同贮存环境条件基因库的种子安全保存期和种子保存寿命存在差异，因此，种子活力监测时间间隔设置应不同。大部分种质资源的保存研究集中在大田作物及常规蔬菜品种上，而对一些特色蔬菜的研究比较少。由于生活水平的提高，一些特色蔬菜种类也开始进入人们的生活，丰富了食用蔬菜品种。特色蔬菜的品种收集、保存有助于相关品种后续的开发及育种研究。通过本研究的监测方法可以初步制定相关品种的保存方法及繁种更新的时间，为后续大规模的特色蔬菜持续引种、保存提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料为韭葱(AlliumporrumL.)、红苋菜(AmaranthustricolorL.)、京水菜(Brassicarapavar.niposinicaL.)、球茎茴香(Foeniculumvulgarevar. dulce)、紫罗罗生菜(LactucasativaL. ‘Ziluoluo’)、大橡叶生菜(LactucasativaL. ‘Daxiangye’)、樱桃萝卜(RaphanussativusL. var. radculus pers)共7种特色蔬菜种子。

1.2 方 法

1.2.1种子干燥及贮存

种子放入干燥箱中进行约3周常规干燥后，取出少量用于后续含水量测定，其余种子分成6份分别用牛皮纸袋包装后装入铝箔袋密封保存，于2009年分别放入-2～2 ℃低温库塑料密封桶内和20 ℃左右室温的玻璃干燥器(含有硅胶)内保存。

1.2.2种子含水量的测定

根据《国际种子检验规程》(ISTA)测定，采用高温烘干法，105 ℃下烘干12 h。每份种子称取5 g，用高温烘干前后的重量计算含水量，重复3次，取平均值。

1.2.3种子发芽势及发芽率的测定

种子生活力主要通过对种子发芽率的监测结果来判断。种子放入垫有一层吸水纸和一层滤纸的发芽盒中，在黑暗的培养箱中进行发芽试验。种子发芽条件为温度(23±2)℃，相对湿度90%。每处理100粒种子，重复3次。每天记录种子发芽数，第3天后计算发芽势，第7天后统计发芽率。

表2 7种蔬菜种子在不同温度下第3年和第12年发芽势测定结果 Table 2 The seed germination rates of 7 vegetable varieties after 3rd year and 12th year storage 单位：%

表3 7种蔬菜种子在不同温度下第3年和第12年发芽率测定结果 Table 3 The seed germination percentages of 7 vegetable varieties after 3rd year and 12th year storage 单位：%

发芽势(%)=(第3天发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽率(%)=(第7天发芽种子数/供试种子总数)×100%。

发芽势及发芽率测定的时间分别为2009年(初始)，2012年(第3年)和2021年(第12年)。发芽势及发芽率数据经SPSS软件分析(p<0.05)。

1.2.4种子安全保存期的预测

种子安全保存期为种子生活力下降至需繁种更新发芽率临界值所用的时间。通过对发芽率过往的3次测定，9组数据，选择Sigmoidal函数进行拟合分析，确定种子活力下降曲线，并通过该曲线推测种子安全保存期(下降至初始生活力85%的时间)、种子保存寿命(种子生活力下降至50%)、种子寿命(生活力完全丧失)所对应的时间点，作为种子库管理及繁种更新的重要依据。

2 结果与分析

2.1 种子入库的含水量及发芽率测定

7种特色蔬菜分别来自于石蒜科、菊科、伞形花科等5个科6个属，仅紫罗罗生菜和大橡叶生菜属于同一个物种的不同品种类型。所有种子依照本单位种质资源库入库常规流程。所有种子初始发芽率都在80%以上，符合入库标准。干燥处理后，经105 ℃高温烘干后所测定的种子含水量约为10%，处于种子保存较安全的含水量范围。

表1 7种蔬菜种子含水量及初始发芽率Table 1 The seed moisture content and initial germination percentages of 7 vegetable varieties

2.2 种子发芽势及发芽率的变化

7种蔬菜种子分别在2009年、2012年、2021年进行发芽试验的(发芽势如表2)。7种特色蔬菜中，5种蔬菜种子的初始发芽势达80%及以上，即在第3天，大部分种子发芽势已经达到80%。

在0 ℃左右低温库保存的种子，监测3次的发芽势数据经ANOVA分析后发现，其中有红苋菜、京水菜、球茎茴香、樱桃萝卜等4种蔬菜种子在12年间的3次发芽势监测数值差异不显著(p<0.05)，表明这4种蔬菜种子在12年里的发芽势变化不明显；韭葱、大橡叶生菜的3次发芽势呈下降趋势，且存在显著的差异；而紫罗罗生菜3次发芽势监测中，第3年的监测数据显著小于初始发芽势和第12年的发芽势，呈“V”型变化。

图2 7种特色蔬菜种子在0 ℃贮存条件下种子生活力下降趋势曲线 Fig.2 The predicted viability curve of 7 vegetable varieties under 0 ℃ conditions

图1 在0 ℃及20 ℃贮藏条件下3次种子生活力监测变化Fig.1 The seed germination percentages changes under 0 ℃ and 20 ℃ conditions of 7 vegetable varieties after 3 tests

相比0 ℃保存的种子，在20 ℃左右低温库保存的种子监测3次的发芽势数据，仅有2种蔬菜种子在12年里的种子发芽势变化不明显，发生变化的是京水菜和球茎茴香2种发芽势监测数值呈显著下降趋势。紫罗罗生菜并未呈现在0 ℃保存时的“V”型变化，而是和大橡叶生菜同样呈显著下降趋势。韭葱的3次发芽势呈现显著的倒“V”变化，即在2012年的监测数据显著高于初始发芽势和2021年测定的数值，而非在0 ℃保存条件所呈下降趋势。

7种蔬菜种子在2009年、2012年、2021年3次发芽试验中的第7天统计发芽种子个数，发芽率如表3。在12年间的3次发芽率监测整体主要的变化趋势如图1，大部分呈现显著持续下降，如韭葱(在0 ℃和20 ℃保存的条件下均呈现发芽率的显著变化)、京水菜(0 ℃和20 ℃)、球茎茴香(0 ℃和20 ℃)、紫罗罗生菜(0 ℃和20 ℃)、大橡叶生菜(0 ℃和20 ℃)、樱桃萝卜(20 ℃)。仅红苋菜(0 ℃和20 ℃)、樱桃萝卜(0 ℃)为变化无显著差异。

2.3 安全保存寿命的预测

种子生活力在贮存过程中随着时间延长往往呈倒“S”曲线变化。对所试验特色蔬菜中3次发芽率监测呈现下降趋势的蔬菜种子存活的变化数据进行了拟合Sigmoidal函数分析，确定相关参数，并通过拟合的生活力变化曲线，如图2，图3，并通过曲线对种子安全保存期、种子保存寿命及种子寿命的3个关键时间点进行了分析和预测。

图2及图3分别是根据7种特色蔬菜种子在0 ℃及20 ℃的3次生活力监测后所预测的生活力变化趋势曲线。从图中可见，每类种子生活力下降曲线变化均存在一定的差异。由于前期监测数据的频次较低，且部分种子的初始发芽率远低于100%，所以图2和图3中显示的种子生活力下降曲线的平台期数据位于以年限为横轴的负半轴中(通过模型计算得出)。随着贮存年限的增加，种子活力逐渐下降，至每类种子初始发芽率的85%，即图中显示绿色区域部分；P50为图中红色曲线，为种子保存寿命。根据试验种子生活力曲线及表4可知，无论在低温中期库还是干燥后经室温保存，大部分种子的安全保存期在10～15年间，即在种子贮存第10～15年需要对种子进行繁种更新。有部分种类的种子如韭葱、球茎茴香生活力下降速度较快，试验的12年期间已经下降至种子保存寿命期限的下限。由于监测数据有限，部分种子的拟合曲线对种子安全保存期及保存寿命的预测可能存在差异，后续监测将持续跟进。

图3 7种特色蔬菜种子在20 ℃贮存条件下种子生活力下降趋势曲线 Fig.3 The predicted viability curve of 7 vegetable varieties under 20 ℃ conditions

3 讨 论

种子成熟后便不可避免的发生劣变，然而作为种质资源，种子需要在基因库中保存10年，甚至数十年。基因库通过低温、干燥等手段延缓种子的衰老进程，延长种子寿命。控制贮藏温度和种子含水量是保持库存种子活力的关键因素。低温库保存种质资源是一种安全有效的途径，但是投资大、常年运转费用高，部分研究单位也试图研究通过降低种子的含水量达到种子在较高含水量且低温下贮藏相同的效果[7]。在本试验中，7种特色蔬菜种子分别在0 ℃低温库和20 ℃左右室温的玻璃干燥器中保存。两组种子在不同温度下12年的保存过程中种子生活力(发芽率)的变化趋势大体一致。尽管两组种子在不同温度条件下保存，但由于所有试验的两组种子在保存前均充分干燥，并用铝箔纸袋密封保存于干燥器(桶)内，与室外空气无交换，在后续第3年和第12年的发芽率监测中，大部分种子的发芽率和发芽势差异不显著。可能是由于种子均经充分干燥并在密封条件下，种子含水量处于较低水平，且保持平衡，种子的生理生化活动在此条件下已经处于较弱的水平，温度对种子的生活力影响较小。孔祥辉[8]曾对几种蔬菜含水量的研究中也认为，当种子含水量较低时，在-20～40 ℃之间设置的6种不同温度条件下均有较好的贮存效果。

在种子贮存的过程中，种子活力随着贮存时间的变化曲线呈现倒S型，种子从平台期进入骤降期的拐点为种子活力丧失关键节点，需要在此阶段及时繁种更新，以免种质资源的丢失。在种质资源库的管理过程中，需要对种子发芽率进行定期检测以确定种质资源是否处于该关键节点。在适宜含水量的密封包装条件下，水稻和小麦在中期库中安全保存寿命为17年，在哈尔滨、西宁等地常温条件下可保存12年[9]。在研究中对种子管理日常常规操作，对大部分种质资源也是往往在第11～12年进行繁种更新。在第12年种子活力监测时，部分种子已经降至种子安全保存期，处于急需繁种更新阶段。可能是由于此批种子入库前临时存放不妥导致种子损伤[10]，推测采收后并未经干燥处理且处于室温环境，入库初始状态处于易劣变的温湿度状态，老化速率加快，缩短了“平台期”的时间，导致在第12年时种子已处于较低生活力状态。

表4 7种蔬菜种子在不同温度下的种子安全保存期、种子保存寿命、种子寿命Table 4 The predicted seed safe storage period, seed safe storage lifespan and seed lifespan of 7 vegetable varieties under different temperature conditions单位：年

确定每种蔬菜种质资源的安全保存期及种子寿命对种子繁种更新，并设置合理的种子生活力监测间隔具有重要的指导意义。FAO所发布的基因库管理标准认为，种子监测时间间隔应设定为安全保存期的1/3[1]，而每批种子的老化速率随着贮存时间的变化会因为每批种子的成熟度、含水量、采收的环境、包装方式、基因库中的温湿度而不一样。Ellis等[11]研究认为，种子老化模式符合Sigmoidal函数曲线，研究了种子活力方程，以此研究种子的寿命及预测种子的活力。Walters等[12]根据已知初始及最终的发芽率等数据，通过阿夫拉米(Avrami)方程计算种子达到P50的年限。宋超等[9]也通过多年发芽监测数据进行Sigmoid拟合。所有对安全保存期及种子寿命只能有一个大致的预测。本研究采用拟合Sigmoidal函数的方法对已有数据进行分析，获得了7种蔬菜种质资源的生活力曲线，并推算出在不同温度下的安全保存期及种子保存寿命(P50)。除了韭葱及球茎茴香的安全保存期仅为一年，且P50约为30年，属于典型的短命种子外[6]，其他作物的种子经干燥后在低温或室温条件下，应在第10～15年进行繁种更新。而对于韭葱及球茎茴香等此类蔬菜，需要采取额外的干燥处理或缩短原有固定的繁种更新年限以避免种质资源的丢失。