沈雁翔 梁言 王鹏 陆燕青 彭勇政 陶懿伟 曾丽*

(1上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2上海莘辛园艺有限公司，上海 201114)

舞春花（Calibrachoa hybrida），又名小花矮牵牛，因其花期长、花量大、花冠颜色丰富、观赏价值高，近年来在园林绿化中得到越来越广泛应用，成为了目前重要的园林绿化草本花卉之一[1-2]。舞春花虽与矮牵牛为同科不同属植物，且舞春花具有矮牵牛缺乏的鲜艳、亮丽的黄色花品种，但两者亲缘关系较远，存在有性杂交障碍（前人对此进行了相关研究，结果表明，两者绝大多数杂种胚胎在授粉后的几天内就停止发育[3]），故难以通过常规杂交技术获得鲜艳、亮丽的黄色花矮牵牛新品种。研究表明，植物原生质体融合是克服远缘杂交亲和性差的一种有效的育种手段[4]，故建立舞春花原生质体分离体系，既能为进一步原生质体培养与融合奠定基础，又能为培育亮黄色矮牵牛及舞春花新品种提供一种新途径[5]。

植物原生质体是指植物细胞壁以内的植物原生质部分。自1960 年首次利用纤维素酶从番茄根尖分离出原生质体以来，目前前人已在水稻、小麦和马铃薯等植物中开展了原生质体融合的相关研究，并实现了种质资源的创新[6-8]。而原生质体融合技术必须建立在高效高产的原生质体分离技术上，前人也已在拟南芥、水稻、玉米、烟草、马铃薯、甜樱桃等植物中建立了原生质体分离体系[9-15]，但关于舞春花原生质体分离的研究较少，仅Meyer等[16]于2009年对12个舞春花品种进行了原生质体分离与培养，但分离效率低、可重复性差；同时，有关黄色花舞春花品种原生质体分离体系的研究目前尚未见报道。在此背景下，笔者拟以黄色花舞春花的幼嫩叶片为实验材料，通过研究其幼嫩叶片的预处理方式和原生质体分离的酶液组合、酶组合渗透压、酶解时间等原生质体分离的关键因素，来获得适宜的舞春花原生质体分离条件，从而建立舞春花原生质体分离体系，进而为舞春花与矮牵牛原生质体融合提供实验材料，以及为舞春花和矮牵牛种质资源创新奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验采用的舞春花品种为泛美种子公司的Calibrachoa hybrid“Lindura Yellow”，该品种的花为黄色，种子购于郑州贝利得花卉有限公司，采用播种育苗方式获得实验材料。实验试剂为甘露醇、2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、二乙酸荧光素（FDA）、纤维素酶R-10、果胶酶Y-23、离析酶R-10、CPW溶液、CaCl2。

1.2 外植体的准备

取舞春花枝条顶芽下第2～5片生长健壮的幼嫩叶片，在黑暗、4 ℃条件下处理1 d，在洗衣粉水中浸泡20 min后，用流水冲洗90 min，再转入超净工作台，用75%酒精浸泡20～30 s，然后用1%次氯酸钠消毒90～120 s，最后用无菌水冲洗3次。

1.3 原生质体的分离和纯化

将准备好的外植体（叶片）切成厚度为0.5 mm的细丝，原生质体的分离和纯化参考王鹏的实验方法[17]。

1.3.1 适宜的离析酶浓度筛选

参照王礼强等[18]的研究方法和Meyer等[16]分离舞春花原生质体的实验条件，设置4个酶解液组合，其中，纤维素酶和果胶酶的含量均为0.2%，离析酶浓度分别为0（Ⅰ号）、0.4%（Ⅱ号）、0.8%（Ⅲ号）、1.2%（Ⅳ号），甘露醇浓度为0.25 mol/L，附加20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）、0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.11%CaCl2，酶解时间为6 h，测定不同离析酶浓度下舞春花原生质体的产量和活力。

1.3.2 适宜的酶解时间筛选

采用1.3.1中的Ⅲ号酶液组合，设置2、3、4、5、6、7 h共6个酶解时间梯度进行酶解，测定不同酶解时间下舞春花原生质体的产量和活力。

1.3.3 适宜的甘露醇浓度筛选

采用1.3.1中的Ⅲ号酶液组合，设置0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L共 5个甘露醇浓度梯度，酶解5 h，测定不同甘露醇浓度下舞春花原生质体的产量和活力。

1.3.4 预处理方式的选择

采用1.3.1中的Ⅲ号酶液组合，甘露醇浓度0.25 mol/L，设置预先质壁分离处理（0.55 mol/L CPW溶液浸泡1 h）、低温黑暗处理（4 ℃放置24 h）、不预处理对照共3个不同的预处理方式，测定不同预处理方式下舞春花原生质体的产量和活力。

1.4 原生质体产量统计和活力检测

采用血球计数板统计舞春花原生质体产量，计算公式为原生质体产量=原生质体个数÷叶片质量，10次重复。

采用二乙酸荧光素（FDA）染色法检测原生质体的活力，即取洗涤过的原生质体悬浮液0.5 mL，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01%，混匀置于室温条件下5 min后，用荧光显微镜观察，有活力的原生质体产生黄绿色荧光，无活力的原生质体则不产生荧光[19]。原生质体的活力采用一个视野内产生荧光的原生质体个数占总数的百分比表示，随机统计10个视野，取平均值。

2 结果与分析

2.1 离析酶浓度对舞春花原生质体产量和活力的影响

由图1可知，不同离析酶浓度会显著影响舞春花原生质体的产量和活力，适宜的离析酶浓度可促进舞春花原生质体的分离。随着离析酶浓度的增加，舞春花原生质体的产量和活力均表现为先增加后降低的趋势，以离析酶浓度为0.8%时，舞春花原生质体的产量和活力表现最好（原生质体形状、大小基本一致，边缘清晰，内含物多，碎片少，产量为4.4×106个/g，活力为76%），离析酶浓度低于0.8%或高于0.8%时，舞春花原生质体的产量和活力均下降。

图1 不同离析酶浓度对舞春花原生质体产量和活力的影响

2.2 酶解时间对舞春花原生质体产量和活力的影响

由图2可知，不同酶解时间会显著影响舞春花原生质体的产量和活力。随着酶解时间的延长，舞春花原生质体的产量表现为先增加后降低的趋势，以酶解时间为5 h的原生质体产量最高，为5.1×106个/g；随着酶解时间的延长，舞春花原生质体的活力表现为逐渐降低的趋势。综合分析，5 h为舞春花叶肉原生质体分离的适宜酶解时间。

图2 不同酶解时间对舞春花原生质体产量和活力的影响

2.3 甘露醇浓度对舞春花原生质体产量和活力的影响

由图3可知，采用甘露醇为渗透压调节剂，随着甘露醇浓度的升高，舞春花原生质体的产量表现为逐渐降低的趋势，舞春花原生质体的活力则表现为先增加后降低的趋势，以甘露醇浓度为0.3 mol/L时，舞春花原生质体活力最高，为83%。经综合分析，甘露醇浓度为0.25 mol/L是舞春花叶肉原生质体分离的适宜浓度。

图3 不同甘露醇浓度对舞春花原生质体产量和活力的影响

2.4 预处理方式对舞春花原生质体产量和活力的影响

由表1可知，不同预处理方式会显著影响舞春花原生质体的产量，但对原生质体活力的影响不显著。经综合分析，低温黑暗处理（4 ℃、黑暗放置24 h）为最适宜的预处理方法，舞春花原生质体产量为5.62×106个/g、活力为87.13%。

表1 不同预处理方式对舞春花原生质体产量和活力的影响

3 讨 论

在进行叶片原生质体分离时，对材料进行预处理可提高分离效果，预处理方式一般有预质壁分离法和低温黑暗处理法两种。其中，预质壁分离法采用CPW溶液和甘露醇等高渗溶液浸泡叶片，使叶肉细胞处于质壁分离的初始状态，这有利于提高细胞壁的酶解效率和促进原生质体的释放；低温黑暗处理法是将植物材料放置在低温黑暗的环境中，通过提高原生质体的活力和细胞膜抵抗外界压力的能力，从而达到提高原生质体的分离效率。在本实验中，分别采用了预质壁分离法和低温黑暗处理法两种预处理方法进行舞春花幼嫩叶片处理，相较于不预处理对照，均提高了原生质体的分离效率，这与李玉株等[20]的研究结果一致。

在采用酶解法分离原生质体时，适宜的酶种类及浓度是关键。目前，植物原生质体分离常用的酶种类有纤维素酶、果胶酶及离析酶，其中，纤维素酶的主要作用是解离细胞壁中的纤维素；果胶酶可用以降解果胶质，促进细胞彼此分离；离析酶是一种多酶复合物，与果胶酶的作用相似，对原生质体分离的伤害较小。不同植物材料因其细胞壁中纤维素、果胶的结构和含量不同，分离原生质体选择的酶种类和浓度不同。例如，蔡肖等[21]以3.0%纤维素酶、0.5%离析酶、0.1%果胶酶的组合酶解液，高效分离出了小叶青杨叶片原生质体；王姿童等[22]在水曲柳原生质体制备中发现，1.5%纤维素酶+0.8%离析酶+0.4%半纤维素酶为最佳组合。同时，酶浓度过低会影响细胞壁酶解效率，酶浓度过高则会对细胞造成伤害。此外，不同的植物材料、酶的质量、酶解过程的振荡频率等，均会影响原生质体的酶解过程。因此，本实验设置了四种酶液组合，其中以2.0%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8%离析酶的酶液组合，对舞春花幼嫩叶片原生质体的分离效果最好。

酶解时间是原生质体分离的核心因素，对原生质体的最终分离效果有很大影响，且采用不同的植物材料、酶液种类及浓度，需要的酶解时间也不同。例如，油棕、杉木的酶解时间分别为3.5 h、2.0 h[23-24]；Yoo等[10]报道，分离拟南芥叶肉原生质体的酶解时间因材料生态型和基因型不同而出现差异，酶解时间一般为3～18 h。同时，酶解时间过短，酶解不充分，会导致原生质体释放不完全、质量不佳、产量低；酶解时间过长，会产生毒害作用，从而损伤细胞膜，造成原生质体活力下降。因此，本实验对舞春花幼嫩叶片的适宜酶解时间进行了研究，随着酶解时间的增加，舞春花原生质体活力降低，原生质体产量先升高再降低，以酶解时间为5 h时，舞春花原生质体产量最高，故舞春花原生质体最适的酶解时间为5 h，该结果与Meyer等[16]的研究结果相比，酶解时间缩短了近10 h。

植物原生质体对外界的渗透压变化敏感，适宜的渗透压是保证原生质体质量的重要因素，外界渗透压过高，会导致原生质体失水皱缩；外界渗透压过低，会导致原生质体吸水胀破。一般在酶解过程中可通过添加甘露醇来调节酶解液渗透压，使其与原生质体内部渗透压基本一致，但是，不同植物的原生质体的渗透压差异较大，需针对不同的植物材料分别进行摸索。因此，本实验设置了5个甘露醇浓度梯度，最终得出舞春花原生质体分离适宜的甘露醇浓度为0.25 mol/L，与已报道的原生质体适宜的酶解液甘露醇浓度为0.23～0.90 mol/L的研究结果相符[25]，但与Meyer等[19]的研究结果不同。

4 结 论

本实验初步探明了舞春花叶肉原生质体的分离条件，即叶片于低温（4 ℃）黑暗条件下预处理24 h，酶液组合为2%纤维素酶+0.2%果胶酶+0.8%离析酶+0.25 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，酶解 5 h，在此分离条件下，舞春花原生质体产量为5.62×106个/g、活力为87.13%。

本实验结论对舞春花的基因研究、遗传改良和新品种培育具有重要意义。