张奥深，雍晓宇，韩巧霞，姚永伟，师焕婷，李鸽子，康国章

(河南农业大学 农学院，国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

小麦作为我国三大粮食作物之一，其产业发展直接影响到国家粮食安全和社会稳定。近年来，随着全球气候变暖，极端低温灾害频繁发生，严重影响了小麦的稳产、高产[1]，其中倒春寒是黄淮麦区最严重的灾害，在我国冬麦主产区黄淮麦区，小麦冻害发生的频率越来越高，对小麦造成的危害也越来越严重[2]。小麦拔节期到抽穗前是小麦生长速度最快，生长量最大的时期，叶面积及茎穗的长度和体积成倍或几十倍增长，干物质积累也进入迅速增长阶段，此时小麦生长旺盛，抗寒能力弱[3]，低温对小麦造成的不利影响较为严重[4]。

油菜素内酯(Brassinolide，BR)又称芸薹素内酯[5]，是广泛存在于植物体内、参与各种生理活动的一种天然化合物，被称为第六种植物激素[6]。BR是公认的高效、广谱、无毒的一种植物生长调节剂。2，4-表油菜素内酯(2，4-Epibrassinolide，EBR)是一种人工合成的高活性油菜素内酯类似物，外施EBR能够提高作物的抗逆能力[7]。尚宏芹等[8]研究表明，叶面喷施EBR可通过提高小麦幼苗的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量、降低MDA和H2O2含量，减轻重金属汞对幼苗的伤害，促进小麦幼苗的生长。孙玉珺等[9]研究表明，外源BR处理可提高幼苗生物量、抗氧化酶活性以及Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量，降低MDA含量，缓解低温胁迫对玉米生长的抑制程度。刘丽杰等[10]研究发现，利用0.1 mg/L的EBR处理小麦幼苗，可提高小麦的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性，可溶性糖和Pro含量显著提高，降低MDA含量，从而提高小麦的抗冻性。前人从生理层面对EBR提高作物的耐受性进行研究，证实EBR对多种逆境胁迫具有缓解作用，但从基因层面对EBR的作用机制研究较少。

本试验以半冬性品种百农207为材料，在小麦拔节期外源浇施EBR，并利用人工气候室模拟低温冻害，研究冻害胁迫条件下小麦植株生理指标、抗逆相关基因表达量、幼穗受冻率、籽粒产量、千粒质量以及地上部干物质质量的变化，探究外源EBR缓解小麦低温冻害的生理机制，以期为减轻倒春寒对小麦的危害提供理论依据和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料与设计

供试材料为普通半冬性小麦品种百农207。试验采用盆栽，2020年秋季种植在河南省郑州市毛庄河南农业大学科技园试验田中，盆的直径为30 cm，高为30 cm，三叶期每盆定苗16株。盆栽用土为0～30 cm的耕层土壤，每盆装过筛壤土8 kg，并均匀施入尿素2.3 g、磷肥0.8 g和钾肥3.4 g，之后埋于试验田中，盆的顶部边缘与地面齐平。

在前期试验筛选EBR浓度的基础上，待小麦生长至拔节期时浇施浓度为0.1 mg/L的EBR 400 mL，对照(CK)施用同等体积的水。小麦植株充分吸收24 h后，将盆栽移入人工气候室内-5 ℃低温连续处理48 h，在处理0，24，48 h分别剪取主茎最上部全展叶，用于生理指标的测定及基因表达分析，每个处理重复3次。

1.2 生理指标测定

在冻害胁迫处理前后利用SPAD-502叶绿素仪测定小麦最上部全展叶的SPAD值，每盆测5片叶片取平均值。利用硫代巴比妥酸(TCA-TBA)显色法测定叶片MDA含量，采用酸性茚三酮法测定Pro含量，利用电导率仪测定叶片相对电导率[11]。

1.3 基因表达分析

取小麦叶片0.1 g，利用总RNA提取试剂盒(Vazyme，南京)提取总RNA，反转录试剂盒(Vazyme，南京)合成cDNA第一链。在前期研究中，小麦高产抗逆分子调控创新团队筛选出与冻害胁迫相关的5个抗逆基因：SOD[12]、POD[13]、CAT[14]、P5CS[15]和WCS120[16]。本研究以小麦Actin作为内参基因，对5个抗逆相关基因进行转录水平的检测。采用软件Primer Premier 5.0设计引物(表1)，由河南尚亚生物技术有限公司进行合成。2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

1.4 小麦幼穗受冻率调查和籽粒产量、千粒质量、干物质质量测定

在拔节期对盆栽小麦外源施用EBR 24 h后，进行冻害胁迫处理(48 h)，自然条件下恢复生长，15 d后调查幼穗受冻后死亡情况，取其平均值计算幼穗受冻率；于成熟期按盆收获籽粒计算籽粒产量；按处理随机选取1 000个籽粒确定千粒质量；将收获后小麦植株地上部放入烘箱，105 ℃杀青30 min后80 ℃烘干，计算干物质质量。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行数据处理，采用SPSS 22.0软件进行方差分析，采用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后植株叶片SPAD值的变化

如图1所示，冻害胁迫前，外施EBR处理组与对照的SPAD值无显著差异，在冻害胁迫后，叶片的SPAD值随冻害胁迫时间的延长呈下降趋势，在同一胁迫时间处理组的SPAD值始终显著高于对照，这表明小麦拔节期外施EBR可以缓解冻害胁迫下叶片衰老，延长叶片的功能期。

柱上不同小写字母均表示在5%水平差异显著。图2—5同。The different lowercase letters on the columns indicate significant differences at the 5% level.The same as Fig.2—5.

2.2 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后植株叶片MDA含量和相对电导率的变化

冻害胁迫处理前外施EBR的小麦植株和对照植株叶片MDA含量差异不显著；冻害胁迫24 h对照组MDA含量显著升高，而外施EBR处理组小麦植株叶片MDA含量与冻害胁迫前无显著变化；而冻害胁迫处理时间达到48 h，二者的MDA含量均较处理24 h显著下降，且处理组MDA含量显著低于对照组。结果表明，拔节期外施EBR可以降低小麦植株叶片MDA含量，从而减轻其膜脂过氧化程度(图2)。

图2 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后叶片的MDA含量Fig.2 MDA content in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

在冻害胁迫处理前外施EBR植株叶片的相对电导率与对照无显著差异，在低温胁迫24，48 h，外施EBR的植株相对电导率均显著低于对照(P<0.05)，分别降低了8.19，7.03百分点(图3)。

图3 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后叶片的相对电导率Fig.3 Relative conductivities in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.3 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后植株叶片Pro含量的变化

由图4可知，对照组在冻害胁迫下，Pro含量呈现逐渐下降趋势；而外施EBR的处理组在胁迫条件下，叶片的Pro含量逐渐上升；在冻害胁迫48 h，处理组小麦叶片的Pro含量显著高于对照组(P<0.05)。

图4 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后叶片Pro含量Fig.4 Proline contents in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.4 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后植株叶片抗逆相关基因表达量变化

在冻害胁迫处理前，除P5CS其余4个抗逆相关基因的表达量处理组均显著高于对照组(P<0.05)；处理组小麦植株在冻害胁迫24 h，叶片中的SOD、POD和CAT的表达量较胁迫处理前均显著降低，而P5CS和WCS120的表达量均显著上升；对照组在冻害胁迫处理24 h，SOD、CAT的表达量较冻害胁迫处理前无显著变化，P5CS和WCS120的表达量均显著上升。冻害胁迫处理48 h与24 h相比，处理组的SOD、POD、CAT和WCS120的相对表达量均显著提高；而对照组的SOD、P5CS和WCS120表达量无显著变化。在冻害胁迫处理48 h，处理组的5个抗逆相关基因表达量均显著高于对照(P<0.05)(图5)。

图5 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后叶片抗逆相关基因的相对表达量Fig.5 Relative expression leaves of stress resistance related genes in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.5 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后植株幼穗受冻率、籽粒产量、千粒质量和干物质质量的变化

外施EBR的处理组小麦植株幼穗受冻率比对照组降低了20.93百分点；处理组的植株籽粒产量和干物质质量每盆分别较对照增加了19.38，54.40 g，处理组千粒质量较对照增加了2.37 g，均显著高于对照。说明在拔节期外施EBR能够提高小麦幼穗的抗冻性和干物质积累量，从而提高小麦产量(表2)。

表2 小麦拔节期外施EBR冻害胁迫后幼穗受冻率、籽粒产量、千粒质量和干物质质量Tab.2 The damage rates of young ears，grain yields，1 000 grains weights and dry matter qualities in wheat under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

3 结论与讨论

油菜素内酯是一种多羟基甾类化合物，是调节植物逆境胁迫伤害的重要生长调节剂，参与不同植物的生长、发育和抵抗外界胁迫等生物学功能[17-18]。外源EBR对植物逆境胁迫缓解方面的生理作用日益受到关注[19-21]。华智锐等[22]研究发现，在干旱胁迫下，经BR处理的小麦幼苗抗氧化酶活性提高，MDA含量降低，相对含水量提高，从而提高了小麦幼苗的抗旱性。李淑叶[23]在低温处理前对棉花叶面分别喷施不同浓度的EBR和蒸馏水，结果表明，外源喷施适宜浓度的EBR较喷施蒸馏水可显著提高叶片Pro含量、净光合速率、植株的干鲜质量，降低MDA含量和相对电导率。唐秀巧等[24]在小麦灌浆期高温前通过叶面喷施磷酸二氢钾(PDP)和BR均能显著延缓灌浆期叶片衰老，促进干物质积累。植物在逆境胁迫下会产生活性氧，破坏细胞膜结构，阻碍叶绿素合成，降低SPAD值，从而破坏光系统，减少植物干物质积累量[25]。本试验研究结果表明，在连续冻害胁迫48 h，外施EBR的处理组小麦MDA含量和相对电导率显著降低，而Pro含量显著提高，SPAD值、籽粒产量、千粒质量和地上部干物质质量均显著高于对照，与前人研究结果一致。

在植物逆境研究中，前人的研究表明，抗氧化酶SOD、POD、CAT 等活性的高低与植物的抗逆能力密切相关[26]，但植物体内其他的水解酶的存在，极易影响抗氧化酶的提取与活性的测定，而进行转录水平的检测则受其他水解酶的影响较小。在前期研究中，本课题组筛选出与冻害胁迫相关的5个抗逆基因SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120。其中，SOD基因控制超氧化物歧化酶的合成，超氧化物歧化酶作为清除植物体内活性氧(ROS)的清除剂，是首个响应逆境胁迫并参与反应的酶[12]；POD基因控制过氧化物酶的合成，过氧化物酶能分解植物体内的H2O2，降低其对细胞的危害[13]；CAT基因控制过氧化氢酶的合成，过氧化氢酶是一种强抗氧化酶，催化H2O2分解成水和氧，在植物对非生物胁迫的响应中起着关键作用[14]；WCS120基因是一种受低温特异性诱导的基因，其编码的蛋白质被认为在小麦的冷驯化过程中起着重要的作用，WCS120蛋白的积累量与高抗冻冬小麦组织的耐寒性呈正相关[16]。吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)是脯氨酸合成中谷氨酸合成途径的关键酶[15]，Pro含量和植物的逆境耐受力呈正相关[27]，植物体内的Pro含量与P5CS基因的相对表达量呈正相关[28-29]。因此，SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120这5个抗逆相关基因的相对表达量可作为小麦抗冻性的参考依据。本试验研究结果表明，在冻害胁迫处理48 h，对照组SOD基因的相对表达量较冻害胁迫处理前无显著变化，POD、P5CS和WCS120均显著升高，而外施EBR的处理组小麦植株，除SOD外POD、CAT、P5CS和WCS120的表达量较冻害胁迫处理前均显著提高，在冻害胁迫48 h 5个抗逆基因的相对表达量均显著高于对照。

在冻害胁迫条件下，抗逆基因转录水平的检测结果与生理指标鉴定结果一致，表明在冻害胁迫下，外施EBR可提高小麦植株的抗氧化酶活性，增加其清除活性氧的能力，降低膜脂过氧化程度；同时P5CS基因的高表达表明，外施EBR可提高植株体内游离脯氨酸含量，增加小麦的抗寒性。SPAD值的显著提高表明，外施EBR可缓解冻害胁迫下小麦叶片衰老，延长其功能期，提高小麦植株物质积累量；幼穗受冻率的检测结果同样表明，在小麦拔节期外施EBR可降低其幼穗受冻率，提高籽粒产量和千粒质量。因此，EBR拔节期外施可起到缓解冻害的效应，从而提高小麦的抗冻性。基于此，在春季低温冻害来临之际，可以通过施用EBR减轻低温冻害对冬小麦生产造成的产量损失。