杨朔 杨杰 章敬程 幺宝金 冷向阳

中医“肾主骨”理论在防治骨疾病方面具有重要价值。肾主骨，治肾亦治骨，从肾论治骨科疾患是历代医家长期遵循的治病原则，一直以来对中医骨伤科临床实践起到了重要的指导作用。对于肾主骨相关机制的研究[1-4]和临床实践正在不断深入。骨痹止痛丸出自“天池伤科”流派第三代传人国医大师刘柏龄教授之手，是刘老以肾主骨理论为基础研发的颇具代表性的经验方。此方中含有淫羊藿、骨碎补等温补肾阳之要药，目前已制成长春中医药大学附属医院院内制剂。在临床实践中，课题组发现骨痹止痛丸对骨性关节炎等退行性疾病确有疗效，尤其适用于肾阳虚证者，但其具体作用机制尚未完全明确。本文旨在研究骨痹止痛丸调控肾阳虚大鼠软骨的作用机制，为骨痹止痛丸的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6周龄雄性大鼠30只，体质量(200±20)g，购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物许可证号： SCXK (辽) 2020-0001。 动物实验经长春中医药大学动物研究伦理委员会批准(批准编号：2021411)。动物自由饮水和进食，在温度(25±1)℃、湿度50%、12小时光照条件下饲养。

1.2 实验药物

本实验中所使用的骨痹止痛丸为长春中医药大学附属医院院内制剂(批号：吉药制字Z20170048)，由长春中医药大学附属医院提供。具体药物组成包括：淫羊藿15 g、骨碎补15 g、莱菔子6 g、鸡血藤10 g、锁阳10 g、熟地黄20 g、狗脊15 g。制备方法如下：将上述7种药物按固定比例进行混合，以蒸馏水浸泡(水面没过药材3 cm)；浸泡2小时后，用砂锅将药物和浸泡液煮沸30分钟，使用绢布过滤回收第一次所得药液，药渣留于砂锅内；再向砂锅中加入蒸馏水，继续沸水煎煮1小时，使用绢布过滤收取第二次所得药液，重复操作1次；将3次所得药液进行混合，通过旋转蒸发仪浓缩获得浸膏，4℃保存[4]。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠联酶免疫吸附法(enzyme unked immunsoybent assay,ELISA)试剂盒(上海优选生物科技有限公司，批号：202006C)，总RNA提取试剂盒(BioTek公司，批号：11752053)，TRIzol Reagent(Invitrogen公司，批号：10296028)，苏木素染色液(珠海贝索生物科技有限公司，批号：BA-4097)，伊红染色液(珠海贝索生物科技有限公司，批号：BA-4022)，荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa，批号：4472920)，氢化可的松混悬液(天津金耀药业有限公司，规格20 mL∶100 MG，批号：2103008S)，4%多聚甲醛溶液(Beyotime公司，批号：P0099)。

高速离心机(Eppendorf公司)，Infnite 200 PRO型酶标仪(Life Science公司)，PCR仪(Eppendorf公司)，紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，FA1004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，Leica RM2255型石蜡切片机(德国Leica公司)，Leica EG1140石蜡包埋机(德国Leica公司)，OlympusBX51光学显微镜(日本Olympus公司)，NIS-ELEMNTBR型图像分析系统(日本NIKON公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与给药 所有大鼠适应性喂养1周后随机分为3组，每组10只，分别为对照组、肾阳虚组和骨痹止痛丸组。对照组大鼠后肢肌肉注谢0.9%生理盐水0.3 mL，每日1次，连续22天。肾阳虚组大鼠后肢肌肉注射氢化可的松混悬液2.5 mg/100 g，每日1次，连续进行22天。骨痹止痛丸组大鼠后肢肌肉注射氢化可的松混悬2.5 mg/100 g，每日1次，连续22天，从第8天开始，按1.05 g/(kg·d)(体表面积折算法人等效剂量)的标准剂量给予骨痹止痛丸水溶液连续灌胃给药[5]，每天灌胃1次，连续进行15天，直至第22天。

1.4.2 动物组织取材 本研究中30只大鼠无死亡情况，在末次给药后12小时，各组大鼠分别用乙醚进行麻醉，而后进行腹主动脉取血。血液离心后取血清并保存在-20℃冰箱中(离心条件：4℃ 3000 r/min离心10分钟)。大鼠处死后取肾脏和整个膝关节，分离软骨组织，一侧肾脏和膝关节软骨放于冻存管中，-80℃保存；另一侧肾脏和膝关节软骨用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 指标检测

1.5.1 一般情况 每日观察大鼠形态及行为学变化，每3日测量各组大鼠体质量并记录。

1.5.2 ELISA检测血清激素 从每组中随机抽取3只大鼠进行检测，具体操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行，检测指标包括促肾上腺皮质激素(adreno cortico tropic hormone，ACTH)、皮质醇(cortisol，CORT)、促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和睾酮(testosterone，T)

1.5.3 肾脏和膝关节软骨组织病理切片 用4%的多聚甲醛溶液将大鼠一侧肾脏和膝关节软骨组织固定过夜，然后进行石蜡包埋，切片机切成3 mm的组织切片，最后用苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光学显微镜下进行拍照观察。

1.5.4 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法检测基因表达水平 从每组中随机抽取3只大鼠，采用qRT-PCR法检测各组大鼠膝关节软骨中Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因的表达水平。引物序列见表1，以Gapdh为表达的内参，采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠体质量与形态变化

肾阳虚组大鼠体质量相比于对照组明显下降(P<0.05)，经骨痹止痛丸治疗后，体质量增加，见表2。此外，肾阳虚组大鼠还出现了疲劳、活动减少、聚集倾向、怕冷、食欲下降、毛发脱落等一系列行为和生理特征，提示肾阳虚造模成功。

表2 各组肾阳虚大鼠体质量比较

2.2 各组大鼠血清激素水平变化

与对照组相比，肾阳虚组大鼠血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明显下降，经骨痹止痛丸治疗后，略有上升，提示大鼠肾阳虚得到改善[6]见表3。

表3 各组肾阳虚大鼠血清激素水平比较

2.3 各组大鼠肾脏、膝关节软骨病理切片情况

对照组肾脏肾小管和肾小球均未见异常变化；肾阳虚组肾小球扩张，近曲小管变性，远曲小管扩张；骨痹止痛丸组肾小球扩张程度相比肾阳虚组减轻，肾小管功能状态改善，近曲小管未见明显变性，远曲小管未见明显扩张。见图1。

注：A 对照组；B肾阳虚组；C 骨痹止痛丸组。

对照组膝关节软骨表现为软骨面光滑连续，软骨细胞数量丰富，细胞分布层次较多，软骨下骨质内骨小梁宽大，分布呈网状，分布密集。肾阳虚组膝关节软骨面失去光滑连续的表面结构，软骨层表面塌陷，凹凸不平，可见纤维成分增生增多，并有少量脂肪组织化生；软骨层明显变薄，软骨细胞固缩，软骨基质成分明显减少，软骨囊内同源软骨细胞群分布明显减少，软骨骨小梁成分分布减少，骨小梁变细变长，骨小梁间连接减少。软骨层所体现的软骨成分与骨小梁所体现的骨组织成分都表现处萎缩、减少；此种变化与中医理论中的“骨痿”相符合。骨痹止痛丸组膝关节软骨层增厚，表面光滑连续；相比肾阳虚组有效增加软骨层中软骨细胞数量，增加软骨基质和同源软骨细胞数目；软骨层下骨小梁成分增宽，分布数量增加。见图2。

注：A 对照组；B肾阳虚组；C 骨痹止痛丸组。

2.4 各组大鼠软骨相关基因表达情况

与对照组相比，肾阳虚组的Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表达水平明显下调(P<0.05)。经骨痹止痛丸给药治疗后，以上基因表达水平明显上调(P<0.05)。这些基因为软骨祖细胞标志物和生长板软骨细胞标志物。将各基因表达的相对差别倍数归一化到内控基因Gapdh，见表4。

表4 基因相对表达量的影响

3 讨论

中医肾主骨理论源自于《内经》[7-8]。在中医理论体系中，肾为先天之本，五行属性为水，为阴中之阳。肾主藏精，包括禀受于父母的先天之精和水谷精微充养的后天之精，二者相互为用，彼此依存。《素问·阴阳应象大论篇》：“肾生骨髓”，髓藏于骨腔之中，以充养骨骼，构成肾主骨的物质基础。国医大师刘柏龄教授崇尚肾主骨的思想，并结合其自身多年临床经验总结确立了“治肾亦即治骨”的学术理念。他认为肾中精气的保养，是人体抵御病邪和防治骨病的重要措施，这与现代医学研究结果不谋而合。本研究中所使用的骨痹止痛丸具有补肾健骨，舒筋通络的功效。肾主骨、生髓，肾虚则骨痿。无论是先天不足还是肾精的后天衰败、房劳伤肾、他病及肾等都可以引起肾病及骨。所以在治疗骨相关疾病时，善用补肾药尤为重要。

现代医学认为肾脏与骨骼组织具有相同的起源，均由中胚层细胞分化并发育而来，预示着肾脏与骨骼在人体的生长发育及受到损伤后的修复过程中可能存在着密切关系。肾脏可以产生骨形成蛋白7、促红细胞生成素等物质，它们可以调节钙磷代谢的平衡及成骨过程中有机质的形成和矿化等环节。同时，有研究发现肾脏通过调节骨保护素和硬骨素的水平，进而影响骨细胞的活性。上述物质在骨的形成、构建、功能维持以及损伤和修复过程中发挥了重要的作用。这些科学研究[9-12]为中医学肾主骨理论提供了必要的科学依据和物质基础。肾通过影响激素的产生和分泌，对骨产生直接或间接的调控作用。如下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴、下丘脑—垂体—性腺轴和下丘脑—垂体—甲状腺轴，肾虚可导致以上3个靶腺轴的功能紊乱，造成垂体、性腺、甲状腺等多个腺体的退行性改变，腺体分泌激素处于异常状态，致使成骨功能下降。有研究表明受下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴系统调控的内源性糖皮质激素通过直接影响成熟成骨细胞Wnt蛋白的表达和分泌，可以间接抑制骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化，并会促使成骨细胞形成[13]。

本研究建立了肾阳虚大鼠模型，研究发现肾阳虚组大鼠相比于对照组，血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明显下降，同时肾阳虚组肾脏病理切片表现为肾小球扩张，近曲小管变性，远曲小管扩张。这提示在肾阳虚状态下，大鼠的肾脏功能受到抑制和损伤。而通过骨痹止痛丸给药治疗，这种抑制和损伤在一定程度上得到了改善。在肾主骨的研究中，软骨是不可割舍的重要部分。本课题组分析了一些软骨相关的重要标志基因。肾阳虚组较对照组Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表达明显下调，而经骨痹止痛丸给药治疗后，这些基因相比肾阳虚组表达水平明显上调。Sox9是一种主转录因子，通过调控靶基因Sox8、Sox5、Sox4、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在软骨发育过程中发挥重要作用[14-16]。此前，本课题组利用转录组测序、同位素标记相对和绝对定量等现代生物学技术，对骨和软骨发育、生长和再生相关的分子机制进行了探索，并证明其潜在的分子机制与肾主骨理论高度一致。本项研究的结果也与本课题组之前的研究结果一致[1-4]。这些结果提示骨痹止痛丸能够有效改善大鼠肾阳虚的病理状态，并通过调控Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因，从而达到保护软骨的效果。

在前期的临床研究[17]中，骨痹止痛丸已经显示出其针对骨性关节炎等退行性疾病的确切疗效，但其具体作用机制尚未完全清楚。本研究以肾主骨理论为切入点探讨骨痹止痛丸调控肾阳虚大鼠软骨的作用机制，发现骨痹止痛丸可通过提高软骨标志物的基因表达水平发挥治疗作用。关于中医药复方的研究，传统的研究方法主要是通过单一的信号通路进行评估，无法系统而全面地揭示中药复方治疗疾病的科学内涵，这也是本研究需要继续完善之处。中医学提倡整体观，如何从整体观念出发，系统而全面地阐释其科学内涵也是未来研究的新方向。在随后的研究中，本课题组将继续围绕“肾主骨”这一方向，尝试从转录组学、蛋白组学以及多组学联合等角度，对其进行更深层次的研究和挖掘。