李晓民 梁韦巍 韩志强 李君 范崇帅 刘志香

皮肤鳞状细胞癌来源于皮肤的鳞状上皮组织，是好发于老年人的常见皮肤恶性肿瘤之一[1]。至今关于皮肤鳞状细胞癌的病因和发病机制尚未明确，可能与化学致癌剂、慢性炎症等有关。了解皮肤鳞癌的发病机制，对于其诊疗具有重要的意义。PI3K/Akt信号通路是参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭等过程的重要通路，其激活可促进肿瘤细胞生长[2]。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)是从葡萄籽中提取的一类活性物质，具有抗氧化、抗炎等广泛生物活性[3-4]。目前多种中医药成分已被证实具有广泛的抗肿瘤活性[5]，GSP作为一种营养补剂已被广泛使用，对乳腺癌、结肠癌、皮肤癌等具有良好的抗肿瘤作用。虽然已有报道GSP能诱导多种恶性肿瘤凋亡，但对人皮肤鳞状细胞癌的凋亡机制尚不明确。本实验使用体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞观察GSP诱导细胞凋亡的作用，并从PI3K/Akt信号通路探讨其对人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人皮肤鳞状细胞癌细胞株(A431细胞，编号：KCB200651YJ)购自中国科学院细胞库。

1.2 细胞培养

用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37°C、5% CO2条件下的二氧化碳孵箱中常规培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞[6]。具体操作如下：使用灭菌的PBS缓冲液清洗细胞3遍，加入0.25%的胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察细胞变圆后加2 mL培养基终止消化，转移到15 mL离心管中离心，弃掉上清液加新鲜培养液重悬细胞，传代培养。

1.3 实验试剂

GSP(货号: 29106-49-8)购自美国Sigma公司。MTT试剂(货号：88417)购自美国Sigma公司。兔抗p-PI3K(货号：bs-5570R)、PI3K(货号：bs-6417R)、p-Akt(货号：bs-2849R)、Akt(货号：bs-0115R)、cleaved caspase-3抗体(货号：bs-0087R)购自北京博奥森生物技术有限公司。鼠抗GAPDH抗体(货号：KC-5G4)购自上海康成生物工程有限公司。抗兔IRdye800(货号：C50331-05)及抗鼠IRdye680(货号：C50520-02)荧光二抗购自美国LI-COR公司。

1.4 实验仪器

二氧化碳培养箱(美国赛默飞世尔科技公司，型号：HF90)；多功能酶标仪(美国分子仪器有限公司，型号：Spectra Max M5)；红外荧光扫描成像系统(美国LICOR公司，型号：Odyssey)；倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社，型号：IX71)。

1.5 MTT法检测人皮肤鳞状细胞癌A431细胞存活率

使用0.25%胰酶消化后，将A431细胞接种于96孔板，每孔为1×104个细胞，于37℃、5% CO2二氧化碳培养箱中培养。加入不同浓度的GSP(5、10、20、40、80 μg/ml)，继续培养24、48、72小时。加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT工作液，置于37℃孵箱中继续孵育4小时，弃掉培养板孔中的液体，加DMSO 100 μL小心震荡使结晶完全溶解后，使用酶标仪于570 nm处检测各组细胞的光吸光度值。GSP组采用灭菌的PBS溶解，加无血清的DMEM培养液处理，正常对照组加等量的PBS。细胞的相对存活率=GSP组/正常对照组×100%。实验重复3次。

1.6 蛋白免疫印迹(western blot)法检测人皮肤鳞状细胞癌A431细胞PI3K/Akt信号通路和cleaved caspase-3蛋白表达

将A431细胞接种于6孔板，每孔加1 mL，每孔1×105个细胞，加入40、80 μg/mL的GSP处理48小时后，收集各组细胞提取蛋白。加适量细胞裂解液，置于冰上裂解30分钟，12 000 r/min、4℃条件下离心30分钟，提取总蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。每组等量的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离、转膜，脱脂牛奶封闭，加孵育一抗(p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3及GAPDH抗体，1∶500)，室温孵育半小时，4℃冰箱过夜。弃去一抗，洗膜，加荧光二抗(1∶5000)孵育2小时，避光洗膜。采用Odyssey红外荧光扫描系统显影分析。蛋白灰度值采用Quantity One软件进行分析。目的蛋白表达水平=(目的蛋白条带灰度值/GAPDH)/(对照组蛋白条带灰度值/GAPDH)×100%。

1.7 观察PI3K/Akt信号通路激活剂对A431细胞凋亡的影响

取对数生长期的A431细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞。正常对照组加入DMEM培养基，GSP组加入40 μg/mL的GSP处理，740 Y-P联合用药组加入PI3K激活剂 (50 μg/mL)和GSP(40 μg/mL)，SC-79联合用药组加入Akt激活剂SC-79(20 μmol/L)和GSP(40 μg/mL)，MTT法检测细胞相对存活率的变化。实验重复3次。

将A431细胞接种于6孔板后，每孔1×105个细胞。细胞随机分为正常对照组、GSP组、740 Y-P联合用药组和SC-79联合用药组，处理同上。Western blot法检测PI3K/Akt通路蛋白磷酸化表达，观察PI3K/Akt通路蛋白磷酸化的变化。实验重复6次。

1.8 数据处理

2 结果

2.1 GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞存活率的影响

MTT结果显示，不同浓度的GSP(5、10、20、40、80 μg/mL)作用不同时间(24、48、72小时)后，A431细胞的相对存活率随着葡萄籽原花青素浓度的升高和处理时间的延长而降低，呈时间浓度依赖性。见表1。

表1 不同浓度GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞存活率的影响

2.2 GSP对A431细胞cleaved caspase-3蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，A431细胞经葡萄籽原花青素(40、80 μg/ml)处理48小时，cleaved caspase 3蛋白表达明显增加，与对照组相比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1、表2。

注：A 正常对照组；B GSP组(40 μg/mL)；C GSP组(80 μg/mL)。

表2 不同浓度GSP对A431细胞cleaved caspase-3蛋白表达的影响

2.3 GSP联合PI3K/Akt通路激活剂对PI3K/Akt通路蛋白表达的影响

为进一步证实GSP是否通过PI3K/Akt通路诱导细胞凋亡，本实验采用PI3K的激活剂740 Y-P及Akt的激活剂SC79与GSP共同处理干预A431细胞48小时后，Western blot法检测p-PI3K和p-Akt的蛋白表达情况。结果显示，与正常对照组相比，GSP组p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显下降(P<0.01)。与GSP组比较，740 Y-P联合用药组p-PI3K蛋白表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。与GSP组比较，SC79联合用药组p-Akt蛋白表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

注：A、D 正常对照组；B、E GSP组；C 740 Y-P联合用药组；F SC79联合用药组。

表3 葡萄籽原花青素联合PI3K/Akt通路激活剂对各组PI3K/Akt通路蛋白表达的影响

采用PI3K的激活剂740 Y-P或Akt的激活剂SC79与GSP共同处理干预A431细胞48小时后，MTT法检测细胞相对存活率的变化情况。与正常对照组相比较，GSP组细胞存活率显著下降；与GSP组比较，740 Y-P联合用药组、SC79联合用药组细胞活性显著上升，表明PI3K/Akt信号通路的激活剂能逆转葡萄籽原花青素对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用。见表4。

表4 葡萄籽原花青素联合PI3K/Akt通路激活剂对细胞相对存活率的影响

3 讨论

皮肤鳞状细胞癌是起源于表皮或附属器角质形成细胞的常见皮肤非黑素恶性肿瘤，发病率高、转移性强，晚期约5%的患者发生恶性转移，已成为危险人类生命的重要疾病之一[7]。目前主要治疗方法是手术治疗[8]，尚缺乏针对人皮肤鳞状细胞癌的有效靶向药物，因而寻求一种能够有效治疗人皮肤鳞状细胞癌的药物具有重要的临床意义。

GSP是一类药理活性很强的天然多酚类物质，具有抗氧化、抗炎、保护心血管、清除自由基等作用。GSP可以通过抑制与活性氧相关信号蛋白的表达对抗氧化应激、减少炎症因子的产生和抑制细胞凋亡。研究发现，GSP可诱导结肠癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌等细胞的凋亡[4,9-11]。葡萄果皮和种子提取物对A431细胞具有明显的细胞毒作用，并能诱导细胞凋亡[12]。原花青素通过降低β-catenin抑制人黑色素瘤细胞增殖并诱导凋亡[13]。本研究采用MTT法检测不同浓度、不同时间GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞活力的影响，结果发现GSP能够呈时间、浓度依赖性地抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的活力。进一步检测GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞cleaved caspase 3蛋白表达的影响，结果发现GSP显著诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞cleaved caspase 3蛋白表达上调。但是，GSP对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞活性抑制并诱导细胞凋亡的作用机制尚不清楚。

PI3K/Akt信号通路是细胞内的重要信号通路[14]，与肿瘤关系密切，通过促进细胞增殖、侵袭及抑制细胞凋亡等方式促进肿瘤的发生发展，已经在乳腺癌、肺癌等的研究中得到了证实。研究发现，在皮肤癌组织中Akt信号通路异常活化，并且该异常活化的信号与癌组织的多种行为关系密切，包括细胞增殖、迁移、细胞凋亡以及血管生成转化等。因而PI3K/Akt信号通路被作为研究皮肤癌的重要靶点。研究表明，原花青素通过调控PI3K/Akt途径抑制结肠癌的增殖和侵袭[15]，促进喉癌TU686细胞自噬并抑制细胞增殖[16]。本实验发现GSP可以显著抑制A431细胞中PI3K/Akt信号蛋白磷酸化，上调细胞凋亡蛋白caspase 3的表达，提示GSP可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制皮肤鳞状细胞癌的增殖。740-Y-P是PI3K的选择性活化剂，SC79是Akt的选择性活化剂，本实验结果显示，GSP联合使用740-Y-P或SC79能够逆转对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞活力的抑制作用，进一步证实GSP可以通过PI3K/Akt信号通路抑制皮肤鳞癌的细胞生长，诱导细胞凋亡。

综上所述，GSP可抑制皮肤鳞癌细胞A431细胞活力，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路实现的。本研究为GSP用于抗人皮肤鳞状细胞癌治疗提供实验依据。