孔妍 邹伟 关睿骞 刘双岭 陈奥 崔乃松

缺血性脑卒中属“中风病”范畴，最早见于《内经》中“卒中”“薄厥”等[1]，是由于脑血流供应不足导致局部脑组织缺血、缺氧引发的急性脑功能障碍性疾病，该病具有“四高一多”的特点，即发病率高、致残率高、致死率高及并发症多[2]，严重威胁到人类的生命健康。缺血性脑卒中占全部脑卒中类型的60%～80%，治愈率极低，且越来越趋于年轻化[3]，如何针对本病给予及时有效的治疗干预，减轻卒中后的各种神经和肢体功能障碍，一直是临床医师研究关注的重点问题。近年来，将中医治疗手段与现代康复技术相结合用于临床各种功能障碍的治疗，已取得了长足进展，其中以针灸和现代康复技术结合应用最为广泛[4-5]。针康法是将头穴丛刺法与康复训练同步结合进行的一种治疗方法，较之单一治疗手法能够更大限度地发挥二者的优势，达到疗效最大化[6]，已在临床广泛应用于脑卒中的康复治疗[7-8]。研究发现，缺血性卒中后星形胶质细胞的激活和反应性胶质化，能够触发级联炎症反应和胶质瘫痕生成，从而加重缺血性神经功能损伤[9-10]。本实验拟通过研究针康法对局灶性脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠神经功能及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)/信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路的影响，探讨针康法干预星形胶质细胞活化保护神经功能的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(250±20)g，购于黑龙江中医药大学GLP实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(黑)-2016-004，并经黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号JZLLSC2019-0160)。于12小时/12小时昼夜循环交替，温度20～22℃，湿度50%～60%实验环境下，适应性喂养1周，维持自由进食、饮水。

1.2 实验试剂

山羊血清封闭液、TBST溶液、苏木素染液(国药集团化学试剂有限公司，批号：191002/S200201/200102)；辣根过氧化物酶、ECL化学发光试剂，Trizol试剂盒，逆转录试剂盒(Sigma-Aldrich公司，批号：191101/020115/200403/200211)；DAB 显色试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：026-01-04/2020-01-02)；鼠抗GFAP、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)抗体、山羊抗兔IgG 二抗(Abcam公司，批号：K200302/K200106/200205)；鼠抗抗体-磷酸化蛋白质激酶(phospho-Janus kinase 1，p-JAK1)、p-STAT3抗体(Santa Cruz公司，批号：sc-200106/sc-200504)。

1.3 实验仪器

Sorvall Stratos冷冻高速离心机(美国Thermo公司，型号208V)；Stuart 组织匀浆器(英国Bibby-Stuart公司，型号SHM2)；Leica光学显微镜(德国 Leica公司，型号DMi8)；紫外可见分光光度计(METTLER TOLEDO公司，型号UV5)；SDS-PAGE凝胶电泳仪(美国Bio-rad公司，型号：165-8029)；Invitrogen iBright凝胶智能成像系统(美国Thermo公司，型号CL1000)；实验室大鼠恒温箱(FU.YI.LIAN公司，型号FYL-YS-280L)。

1.4 分组与造模

90只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组、针康组共 5组，每组各18只。模型组和各治疗组均采用Longa改良线栓法建立大鼠MCAO模型[11]：大鼠称重后以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，常规消毒颈部皮肤，取颈部正中部位切口，钝性分离右侧颈总动脉和颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉近心端与颈外动脉处用缝合线结扎，在颈外动脉分叉处做一直径约0.20 mm的V型切口，将线栓自切口处导入动脉管腔，在插入线栓的同时松开动脉夹，线栓插至深度约(18.50±0.50)mm处，遇明显阻力时停止，造成大鼠脑缺血，在缺血90分钟后将线栓拉出进行再灌注。假手术组不进行血管结扎及线栓导入，其他操作相同。于大鼠麻醉清醒后采用Zea-Longa’s级标准评分法对大鼠进行神经功能评分，评分为1～3分即为造模成功，可进行下一步实验。

1.5 干预方法

(1)针刺组：于造模后第2日开始给予头穴丛刺法干预治疗，参考《实验动物穴位图谱》取百会穴及百会左、右侧各旁开2 mm处(顶区)作为刺激区，以华佗牌针灸针(0.25 mm×25 mm)向前平刺至顶前区，深度0.5寸，快速捻转(频率200转/分钟)5分钟后留针6小时，留针期间每1小时捻转一次，每次5分钟，每日针刺1次。(2)康复组：各组大鼠均于造模前给予适应性跑台训练3天，康复组大鼠于造模后第2日开始给予跑台训练，均为每次30分钟，每日1次。采用五跑道电动跑台，设定跑台斜度为0°，跑台履带不断向后传输，履带尾部带有电栅栏，为避免电栅栏的电击，大鼠需不断自主向前奔跑，履带传输速度：术前3天为12 m/分钟，术后第1日为5 m/分钟，术后第2日为8 m/分钟，第3日及以后为12 m/分钟。(3)针康组：于造模后第2日开始给予头穴丛刺法结合跑台康复训练。(4)假手术组、模型组：造模后不给予任何干预治疗，仅放回笼中正常饲养。

1.6 观察指标

1.6.1 神经功能评分 (1)Zea-Longa’s级标准评分[12]：采用Zea-Longa’s级标准评分法分别于治疗第6小时、3天、7天、14天对大鼠进行神经功能评分，评分按照0～4分五级评分：0分为行为正常，无神经功能缺损症状；1分为提尾时左前肢屈曲；2分为行走时左前肢屈曲并躯体自发性向左转圈；3分为躯体左侧偏瘫；4分为意识障碍，无法自发行走，分值越高表示神经功能损伤越严重。(2)mNSS评分[13]：采用改良神经功能缺损评分(mNSS评分)分别于治疗第6小时、3天、7天、14天对大鼠神经功能进行评价，该评分法包括运动、感觉、平衡功能及反射水平等多个方面的测评，能够全面反映出脑缺血大鼠的神经功能损伤情况，总分为18分，分值越高表示神经功能损伤越严重，其中0～6分为轻度损伤；7～12 分为中度损伤；13～18分为重度损伤。

1.6.2 免疫组化法检测脑组织GFAP、EGFR阳性表达 神经功能评分后，腹腔麻醉大鼠，迅速开胸暴露心脏，采用4 ℃，0.9%生理盐水和4%多聚甲醛溶液依次心脏灌注，待大鼠死亡后断头取脑，将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定处理，常规脱水，石蜡包埋切片，在3% H2O2中室温孵育10分钟，微波抗原修复，血清封闭30分钟，滴加稀释的一抗，4℃保存过夜，PBS冲洗3次×2分钟，滴加稀释的二抗，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次×2分钟，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片，置显微镜下观察，每组随机选取5个高倍镜(×400)下视野，采用Image-pro plus 6.0图像分析系统对阳性表达进行分析，以阳性细胞计数代表蛋白表达量。

1.6.3 WB检测脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达 神经功能评分后，同“1.6.2”方法心脏灌注处死大鼠后断头取脑，脑组织以4 ℃，0.9 %生理盐水清洗干净，研磨粉碎，加入足量新鲜配制的蛋白裂解液，4℃下匀浆处理30分钟，12000 r/分钟高速离心10分钟，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1小时，TBST 洗膜后，滴加稀释的一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)，室温孵育1小时，TBST洗膜后，ECL显色、曝光，以GAPDH为内参，采用Image J凝胶成像分析系统对电泳图像进行分析，以各目的蛋白与GAPDH的光密度比值代表蛋白的相对表达量。

1.6.4 RT-PCR检测脑组织GFAP、EGFR mRNA水平 神经功能评分后，同“1.6.2”方法心脏灌注处死大鼠后断头取脑，脑组织以Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度法检测总RNA浓度。采用逆转录试剂盒获得 cDNA后进行PCR扩增反应，反应程序为：95℃预变性3分钟，变性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸30秒，共40个循环。以GAPDH为内参，采用Invitrogen iBright凝胶成像分析系统对电泳图像进行分析，以2-△△Ct值计算蛋白的相对表达量。PCR引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 Zea-Longa’s级标准评分比较

模型组和各治疗组大鼠在不同时间点的Zea-Longa’s级标准评分均较假手术组明显增加(P<0.05)，各组Zea-Longa’s级标准评分随时间呈现下降趋势；其中，各治疗组大鼠在第3天、7天、14天时的Zea-Longa’s级标准评分均较模型明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组MCAO大鼠Zea-Longa’s级评分比较(分,¯

2.2 mNSS评分比较

模型组和各治疗组大鼠在不同时间点的mNSS评分均较假手术组明显增加(P<0.05)，各组mNSS评分随时间呈现下降趋势，其中，各治疗组大鼠在第3天、7天、14天时的mNSS评分均较模型组明显降低(P<0.05)，针康组在第6小时的mNSS评分亦较模型组明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组MCAO大鼠mNSS评分比较(分,

2.3 脑组织GFAP、EGFR阳性表达

免疫组化结果可见，模型组和各治疗组大鼠脑组织GFAP、EGFR阳性细胞计数均较假手术组明显增多(P<0.05)；各治疗组大鼠脑组织GFAP、EGFR阳性细胞计数均较模型组明显减少(P<0.05)，且以针康组阳性细胞计数为最低。见表4、图1。

表4 各组MCAO大鼠脑组织GFAP、EGFR阳性细胞计数比较(个

图1 各组MCAO大鼠脑组织GFAP、EGFR阳性表达(DBA，×400)

2.4 脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达

WB结果可见，模型组和各治疗组大鼠脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达均较假手术组明显增加(P<0.05)；干预后，各治疗组大鼠脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达均较模型组明显降低(P<0.05)，且以针康组为最低。见表5、图2。

图2 各组MCAO大鼠脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达

表5 各组MCAO大鼠脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达

2.5 脑组织GFAP、EGFR mRNA水平

RT-PCR结果可见，模型组和各治疗组大鼠脑组织GFAP、EGFR mRNA水平均较假手术组明显增加(P<0.05)；干预后，各治疗组大鼠脑组织GFAP、EGFR mRNA水平均较模型组明显降低(P<0.05)，且以针康组为最低。见表6。

表6 各组MCAO大鼠脑组织GFAP、EGFR mRNA水平比较

3 讨论

缺血性脑卒中归属于中医学“中风”“卒中”“薄厥”等范畴，本病病位在头部，为人体经气汇聚之所，《灵枢·五乱》记载“气乱于头则为厥逆, 头重眩仆……取之天柱。”可见，头部穴位与人体脏腑器官及经络气血功能有着密切联系[14]。头穴丛刺取头顶区百会穴及左、右侧各旁开2 mm处，主要对应大脑中央前回、中央后回及旁中央小叶等区域，配合长留针、间断捻转手法，尤适用于脑卒中后运动、感觉障碍的治疗[15]。针康法是头穴丛刺法与现代康复治疗的有机结合，即在头穴丛刺长留针期间，同步进行各种运功康复训练[16]，临床用于脑卒中的治疗，疗效确切，其核心治疗思想为“针康同步、动态治疗、整体康复”，其中，头穴丛刺法可通过针刺效应透过颅骨，直接刺激大脑皮质，作用于责任病灶；康复训练则作用于四肢，通过多次重复康复运动，间接刺激中枢神经系统，提高脑神经元功能可塑性，促进受损神经功能恢复，二者双向调节、同步作用，以实现疗效最大化[17-18]。

近年来，关于针康法干预治疗脑缺血再灌注损伤的机制研究屡见报道，如针康法可能通过促进脑缺血区域皮质突触可塑性，降低脑缺血后神经细胞损伤，加速神经功能重建[19]；其可通过下调Caspase-3 mRNA和蛋白，抑制海马神经元凋亡，促进脑卒中后神经功能恢复[20]；或可上调脑缺血区皮质微血管计数及海马SDF-1A mRNA表达，参与血管内皮细胞迁移和增殖，降低脑缺血再灌注后神经损伤[21]，然而，关于针康法干预星形胶质细胞活化改善脑缺血再灌注损伤的机制研究目前尚未见报道。研究发现，星形胶质细胞作为中枢神经系统中数量最多的细胞，在脑缺血状态下，发挥着双重作用[22-24]：一方面，脑缺血后星形胶质细胞能够迅速活化为反应性星形胶质细胞，通过分泌神经营养因子、促红细胞生成素及谷胱甘肽等抗氧化物质，发挥神经保护作用；另一方面，活化后的星形胶质细胞可通过分泌多种炎症介质、兴奋性氨基酸、细胞毒性因子等物质进一步损伤脑神经。同时，星形胶质细胞过度增生形成的胶质瘢痕，可压迫局部脑组织，抑制微血管生成，阻碍局部脑血流恢复，进一步加重脑组织缺血缺氧情况[25]。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，能够反应出星型胶质细胞的反应性和重塑性[26]。EGFR是一种酪氨酸激酶型受体，广泛分布于活化的星形胶质细胞中，能够反映出星形胶质细胞的分化与增殖情况[27]。脑卒中后，GFAP、EGFR在星形胶质细胞中均呈现高表达，且与神经功能损伤程度密切相关[28]。STAT3 是信号转导子和转录激活子(STAT)家族成员之一，在活跃状态下可与 GFAP 启动子位点结合，诱导酪氨酸快速磷酸化，促进星形胶质细胞的活化、增生[29]。STAT3同时是 EGFR下游的重要效应分子之一，其可通过与细胞表面受体结合后诱导受体上的酪氨酸残基磷酸化和核转位，进而刺激星形胶质细胞活化，加速神经细胞损伤[30]。由此可见，对脑卒中后星形胶质细胞的活化机制进行深入研究，抑制其活化和反应性胶质化，对于改善脑卒中后继发性脑损伤，促进神经功能恢复具有重要的意义。

本研究采用针康法干预治疗MCAO大鼠，通过研究该方法对脑卒中后神经功能及GFAP/STAT3通路的影响，探讨针康法干预星形胶质细胞活化发挥神经保护作用的相关作用机制，也为临床寻找治疗缺血性脑卒中的新作用靶点和治疗方案提供数据支持。结果显示，治疗干预后，针刺组、康复组和针康组大鼠的的Zea-Longa’s级标准评分和mNSS评分在第3天、7天、14天时均较模型组明显降低(P<0.05)，且各组评分均随时间呈现下降趋势。免疫组化和RT-PCR结果可见，各治疗组大鼠在干预治疗后的脑组织GFAP、EGFR阳性细胞计数和mRNA水平均较模型组明显减少(P<0.05)，且以针康组为最低。WB结果可见，各治疗组大鼠在干预治疗后的脑组织P-JAK1、P-STAT3蛋白表达均较模型组明显降低(P<0.05)，且以针康组为最低。研究结果提示：针康法能够明显改善MCAO大鼠神经功能损伤，并降低缺血脑组织GFAP、EGFR、P-JAK1、P-STAT3等蛋白及基因表达。

综上所述，针康法干预治疗脑缺血再灌注大鼠能够有效改善神经功能损伤，该作用机制可能是通过调控GFAP/STAT3通路抑制星形胶质细胞活化实现的。